miR-1269在胃癌及胃黏膜癌前病变组织中表达及其临床意义

刘 谦，夏兴洲，李金丽，王文真，李冲慧，王万聪

郑州大学第五附属医院消化内科，河南 郑州 450052

胃癌是较常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，尽管其临床治疗手段不断提高，但临床治疗效果仍不理想，其致死率位居我国恶性肿瘤的第三位[1-2]。究其原因主要与胃癌的复发和转移有关，因此，探究胃癌分子生物学机制，早期明确其诊疗靶标，临床意义重大[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码小RNA，长度为20～23个核苷酸，在转录后可调控靶基因的表达，导致mRNA降解或翻译抑制，从而参与肿瘤的发生、发展[4]。miR-1269在肺癌、肝癌等恶性肿瘤中发挥重要作用，但临床对miR-1269与胃癌及胃黏膜癌前病变的研究报道较少。因此，为探讨胃癌及胃黏膜癌前病变组织中miR-1269的表达及临床意义，本院对近年收治的50例胃癌患者、50例胃黏膜癌前病变患者及50例浅表性胃炎患者进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2018年2月郑州大学第五附属医院收治的50例胃癌患者、50例胃黏膜癌前病变患者及50例浅表性胃炎患者作为研究对象，均经胃镜检查、手术治疗及病理学诊断，术前均未接受放化疗等治疗。其中，胃癌组(50例)：男29例，女21例；年龄(56.09±3.97)岁(38～72岁)；肿瘤直径(5.27±1.02)cm(1.2～9.5 cm)；分化程度：中高分化18例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期17例，Ⅲ期16例，Ⅳ期14例；淋巴结转移31例；深层浸润34例。胃黏膜癌前病变组(50例)：男26例，女24例；年龄(55.46±3.24)岁(36～74岁)；异型增生28例，萎缩性胃炎伴肠上皮化生22例。浅表性胃炎组(50例)：男27例，女23例；年龄(54.93±3.63)岁(33～69岁)。3组一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院伦理学委员会审批，患者及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 组织样本采集：3组组织样本均于术后15 min内采集，均经0.9%氯化钠溶液冲洗后予以液氮冷冻处理，并于-80 ℃的冰箱中保存待用。

1.2.2 试剂与仪器：RT-PCR试剂盒、逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；TRIzol试剂由美国Roche公司提供；7500型RT-PCR仪购自美国ABI公司；紫外分光光度计由美国莫赛飞公司提供。

1.2.3 引物与内参：miR-1269上游引物序列为：5′-GCAAAGUGAUGCAGCUGUUUGCAGCUCAAAUGGCC-

UUUCGCAAU-3′，下游引物序列为：5′-AUCGCACAUAGGCUCGACUUCAU-3′；内参U6引物序列为：5′-CCTGTCGGGCCTACACA-3′(正向)，5′-AGCTACTCAATCGATGTCTG-3′(反向)；miR-1269逆转录引物序列为：5′-GUCUACUGAUCGUGCCCUUGCGAUCAAGG-

GUCGGAAACUUAACUGCCGCAAGA-3′；内参U6逆转录引物序列为：5′-CTACGCTGCATGATTGCATGCTT-3′。miR-1269引物由上海生工生物工程有限公合成。

1.2.4 总RNA提取：取50 mg左右样本组织超声匀浆，按RNA提取试剂盒步骤提取基因组RNA，经双蒸水溶解后检测RNA的完整性，RNA纯度及浓度采用紫外分光光度计进行检测。

1.2.5 逆转录反应：反应体系为20 μl，根据逆转录试剂盒说明书进行操作，冰上依次加入：1 μmol/L逆转录引物3 μl、模板RNA 1 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制剂0.19 μl、10×RT buffer 1.5 μl、逆转录缓冲液 1.0 μl，加双蒸水水补至20 μl。反应条件：20 ℃ 15 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，逆转录产物4 ℃保存。

1.2.6 PCR扩增：反应体系为20 μl，根据PCR试剂盒说明书进行操作，冰上依次加入：上游引物及下游引物各1 μl、SYBR Green Ⅱ Mix 10 μl、逆转录产物1 μl，加双蒸水补至20 μl。反应条件：95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35个循环。

1.2.7 结果分析：采用2-△△Ct方法计算miR-1269表达水平，以U6为内参，每组取3个复孔均值，根据各样本的平均Ct 值，以2-ΔΔCt表示miR-1269相对表达水平，miR-1269相对表达量以Δ2-ΔΔCt值=2-ΔΔCt值(miR-1269)-2-ΔΔCt值(U6)。

2 结果

2.1 miR-1269在胃癌组织、胃黏膜癌前病变组织及浅表性胃炎组织中的表达RT-PCR 检测结果显示，miR-1269在胃癌组织中的相对表达量为(6.03±0.97)，miR-1269在胃黏膜癌前病变组织中的相对表达量为(4.07±0.82)，miR-1269在浅表性胃炎组织标本中的相对表达量为(3.81±0.75)，3组比较差异有统计学意义(F=9.889，P=0.000)。miR-1269在胃癌组织中的相对表达量明显高于胃黏膜癌前病变组织及浅表性胃炎组织(t=10.912、12.803，P=0.000)。

2.2 miR-1269的表达与胃癌患者临床病理特征的关系miR-1269在不同性别、年龄及肿瘤直径患者胃癌组织中的表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；miR-1269在不同分化程度、TNM分期、浸润程度、是否发生淋巴结转移的胃癌组织中的表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，即分化程度越低、TNM 分期越高、浸润深度越深、发生淋巴结转移，则胃癌患者癌组织中miR-1269的相对表达量越高(见表1)。

表1 miR-1269的表达与胃癌患者临床病理特征的关系Tab 1 Relationship between expression of miR-1269 and clinicopathological features of patients with gastric cancer

2.3 miR-1269诊断胃癌的ROC曲线分析miR-1269诊断胃癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.807(95%CI：0.614～1.829)，诊断临界值0.549，诊断灵敏性为88.21%，特异性为79.46%，约登指数为0.758(见图1)。

图1 miR-1269诊断胃癌的ROC曲线图Fig 1 ROC curve of miR-1269 for diagnosis of gastric cancer

2.4 miR-1269的表达与胃癌患者预后的关系在50例胃癌患者中，48例(96%)完成随访，2例(4%)失访；随访时间(19.67±3.1)个月(11～37个月)。在完成随访的48例患者中，按miR-1269的表达水平将患者分为高表达组(miR-1269的表达水平高于平均值)和低表达组(miR-1269的表达水平低于平均值)，其中，高表达组19例，死亡8例，死亡率为42.11%；低表达组29例，死亡4例，死亡率为13.79%，两组死亡率比较，差异有统计学意义(χ2=4.907，P=0.027)。由生存曲线可知，高表达组胃癌患者的平均生存时间明显短于低表达组，平均生存时间分别为16.5个月和23.7个月(见图2)。

图2 Kaplan-Meier 生存曲线分析miR-1269的表达与胃癌患者预后的关系Fig 2 Kaplan-Meier survival curve analysis of the relationship between the expression of miR-1269 and the prognosis of patients with gastric cancer

3 讨论

胃癌是我国临床最常见的恶性肿瘤之一，其临床死亡率较高，这主要是由于胃癌早期症状隐匿、内窥镜筛查率低等原因导致多数患者在确诊时已处于晚期，且经外科手术和化疗辅助治疗后的复发率一直较高，致使患者的预后较差[5-7]，因此，探寻有效的治疗胃癌的靶向药物和技术手段显得尤为重要。近年来，尽管胃癌治疗规范已逐步完善，也开始出现新的化疗药物即靶向药物，但胃癌的总体治疗效果并不理想[8]。因此，寻找新的研究方向，进一步探究胃癌的分子生物学机制，早期明确其诊疗靶标，临床意义重大[3]。miRNA是一类非编码小RNA，长度为20～23个核苷酸，在转录后可调控靶基因的表达，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而参与肿瘤的发生、发展[9-10]。既往研究表明，miRNA与胃癌的发生、发展存在相关性[11-12]。本课题组前期利用Affymetrix miRNA表达谱芯片检测了胃癌细胞培养的肿瘤球与贴壁细胞差异表达miRNAs，其中miRNA-1269为差异比较明显的miRNAs之一，其在肿瘤球中表达明显下调。然而，miRNA-1269作为近年来新发现的miRNA，临床对其与胃癌的关系研究报道较少。

本研究发现，miR-1269在胃癌组织中的相对表达量明显高于胃黏膜癌前病变组织及浅表性胃炎组织，结果提示，miR-1269在胃癌组织中表达上调。有学者对miR-1269与肺癌进行研究，发现miR-1269在肺癌组织中的表达增加，其在肺癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织，过表达的miR-1269通过抑制TP53和Caspase-9的表达而促进细胞存活和增殖[13]。另有学者研究发现，miR-1269a的过表达可抑制胃癌细胞的凋亡，这与本研究结果一致[14]。

本研究显示，miR-1269在不同分化程度、TNM分期、浸润程度、是否发生淋巴结转移的胃癌组织中的表达量比较,差异有统计学意义，结果提示，miR-1269在胃癌组织与胃黏膜癌前病变组织中的表达存在差异，分化程度越低、TNM 分期越高、浸润深度越深、发生淋巴结转移，则胃癌患者癌组织中miR-1269的相对表达量越高。进一步采用ROC曲线进行分析，结果显示，miR-1269诊断胃癌的AUC为0.807(95%CI：0.614～1.829)，诊断灵敏性为88.21%，特异性为79.46%。结果提示，miR-1269诊断胃癌的敏感性和特异性均较高。有学者研究报道，miR-1269高表达于肝细胞癌组织，且miR-1269的表达水平与淋巴结转移、肿瘤浸润等存在相关性，miR-1269可能参与肝细胞癌的发生和发展，miR-1269可作为预测肝细胞癌患者预后的潜在生物标志物[15]。

进一步对50例胃癌患者进行随访，结果发现，48例(96%)完成随访，其中，miR-1269高表达组19例，死亡8例，死亡率为42.11%；miR-1269低表达组29例，死亡4例，死亡率为13.79%。由生存曲线可知，高表达组胃癌患者的平均生存时间明显短于低表达组，提示胃癌组织中miR-1269表达越低的胃癌患者生存时间越长，预后越好。

综上所述， miR-1269在胃癌组织中呈高表达，且其表达水平与胃癌的发生、发展及预后有关，miR-1269可能在胃癌的发病过程中发挥了促癌作用，其可能成为胃癌临床诊疗及预后评估的生物学标志物。