微小RNA和胆固醇稳态研究综述

孙焕平，王 凯

1 前言

胆固醇作为两类最主要的细胞脂质物质之一，是真核细胞细胞膜的重要结构成分。它是类固醇激素和胆汁酸的前体，是一种天然的生物活性剂，能够作为信号分子参与多种细胞功能[1]。由于胆固醇对细胞的基本功能，当维持胆固醇稳态的调节网络受到干扰会导致机体产生严重临床病症，如动脉粥样硬化、肥胖症和糖尿病等[2]。因此，机体调节网络机制能够平衡细胞内和细胞膜水平的胆固醇水平，以适应生理变化的需要。机体通过甾醇生物合成，脂蛋白摄取，脂肪分解动员固醇和内流及外流的反馈调节，在转录和转录后水平维持胆固醇稳态[3]。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是胆固醇稳态转录通路中关键的调节因子。SREBP有三种主要亚型；SREBP-1a和SREBP-1c来自SREBP1基因中染色体11上的两个独立启动子，可产生独特的5′非编码区(5′UTR)氨基末端mRNA；SREBP-2来自SREBP2基因中染色体15上。SREBPs协调调控胆固醇和脂肪酸的生物合成，研究表明，SREBP-1c作为一种相对较弱的转录激活因子优先参与脂肪酸代谢基因的激活，而SREBP-1a激活胆固醇和脂肪酸代谢基因；SREBP-2优先激活胆固醇代谢的基因。

不同的SREBP亚型在转录水平上，通过不同的组织特异性信号传导途径进行独立调节，使内质网膜上大约1100种氨基酸前体被表达。当细胞固醇水平较低时，内质网膜相关的SREBP前体形成复杂的SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)，并被转运至高尔基体使氨基末端成熟的SREBP在其膜上被水解释放。这些活性转录因子被转运至细胞核，诱导核内与胆固醇生物合成，脂蛋白摄取和脂肪分解相关的基因转录[4]。有研究表明，胆固醇水平能调控SREBP从内质网至高尔基体的转运，多不饱和脂肪酸等其他信号也能调节SREBP-1同系物的成熟[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一组内源性的，由20-25个核苷酸非编码组成的RNA，其能够通过与自身目标mRNA的3′非编码区(3′UTR)不完全碱基配对，来诱导靶基因的降解或是翻译抑制，从而完成对蛋白质合成的调节[4]。另有研究表明，miRNA也可以通过与其他区域(包括5′UTR或蛋白质编码的外显子)结合抑制mRNA的靶标[5]。此外研究发现，单独miRNA不仅可以在mRNA的3′UTR中配对多个靶点位，而且单独mRNA也可被多个不同miRNA共同靶标，这表明miRNAs利用协同作用调控基因表达[6]。现已证实miRNA调节胆固醇稳态的关键因子，涉及miRNA表达水平的改变与胆固醇代谢紊乱高度相关[2]。位于SREBP内含子中的miRNA有助于维持体内胆固醇平衡，影响高密度脂蛋白(HDL)生命周期[6]，改善脂肪酸代谢和胰岛素信号释放[7]。因此，miRNAs转录后调控作用除了激活复杂的转录因子外，还是维持细胞内胆固醇代谢调节网络稳定的关键。

2 miRNA的生物合成及转录

miRNA在哺乳动物的生物合成中，大多数miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)转录生成长链的初级miRNA转录物(pri-miRNA)，随后被加帽聚腺苷酸化并剪接产生pre-miRNA[7]。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)转录[8]。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)Drosha瞬间将pri-miRNA中间体切割成包含约70-90个核苷酸的茎环状pre-miRNA。紧接着由Ran-GTP 依赖性核转运受体 Exportin5将pre-miRNA运送至细胞质，并由细胞质中Dicer酶进一步处理以产生成熟的miRNA，其长度约为22个核苷酸。成熟的miRNA与Argonaute家族蛋白(AGO)结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，RISC通过不完全碱基配对使mRNA的3'UTR与miRNA的“种子”区域特异性结合，最后增强mRNA翻转和/或转录抑制[9]。

miRNA表达受到组织特异性和发育阶段异性控制。大多数miRNA基因转录是由RNA Pol II介导的，他们的启动子在蛋白质基因编码中被认为具有序列特征和转录调控机制[10]。事实上，高通量测序和生物信息学方法已经揭示，miRNA基因近端上游区域具有TATA盒、启动子元素、TFIIB识别元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量转录因子结合基序[11]。此外，最近的研究已经预测miRNA启动子区域接近转录起始位点，暗示表观遗传机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰对miRNA表达调控的作用[12]。为了更好地理解miRNA基因的多样性、功能和生物合成，需要关于替代、剪接启动子和miRNA基因加工的更详细信息。

3 miRNA在胆固醇生物合成中的作用

3.1 胆固醇平衡调节回路：SREBP和miRNAs

研究表明，miRNA 能够直接或者间接影响相关转运蛋白和催化酶的活性，参与胆固醇合成、运输，在机体胆固醇稳态维持过程中发挥关键性作用[8，9]。

SREBP-1a和SREBP-1c参与脂肪酸和葡萄糖等能量代谢相关基因表达，而SREBP-2更具特异性的参与胆固醇代谢基因的转录调控[3]。胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)是主要的膜上胆固醇传感器，内质网中不活跃的SREBP前体能够直接与SCAP交互作用。当内质网膜阈值水平高于5mol/%时，SCAP直接结合胆固醇，并维持与胰岛素诱导基因(insulin induced gene，INSIG)结合的构象，促使SREBP进入内质网中。然而，当内质网膜胆固醇低于5%时，SCAP构象发生改变，不再与INSIG相互作用。这使得SCAP与外被蛋白(coat protein Ⅱ，COP II)相互作用，将SCAP-SREBP复合物运送至高尔基体。进入高尔基体后，SREBP经过位点1和位点2蛋白酶协同一致的两步蛋白水解作用，释放代表成熟转录因子的氨基区域并迁移至细胞核，激活SREBP靶基因的表达。细胞核内SREBPs是不稳定的，并能被泛素-蛋白酶体系统通过靶向E3泛素连接酶F-box和F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)降解[4]。最近研究发现，小鼠和人类肝脏组织中miR-183、miR-96、miR-182操纵子被SREBP-2直接激活。SREBP-2与TSS附近的miR-183/96/182转录单元的保守结合位点相互作用，促进三个miRNA的多顺反子转录。miR-182靶向FBXW7，miR-96靶向INSIG2，建立调节SREBP活性的正反馈回路，从而维持胆固醇稳定[13, 14]。

另有研究表明，miR-24靶向INSIG1也会对SREBP水平产生积极影响[15]，但miR-24如何调控体内SREBP平衡机制还有待确定。尽管如此，在饮食诱导的肥胖小鼠中拮抗miR-24仍能通过下调脂质基因表达，显著降低血浆和肝脏脂质水平。在非酒精性脂肪肝或脂肪性肝炎患者中也观察到高水平的miR-24以及更低水平的INSIGI[16]，说明miR-24和INSIGI之间的作用可能参与调控代谢性疾病中脂质平衡。

miR-185表达受SREBP-1c调控， SREBP-1c与miR-185的启动子区域内特定基序结合。在这种情况下，通过体内和体外靶向SREBP-2的3′UTR导致胆固醇代谢基因功能失活，例如羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGCR)和低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达降低。脂肪酸是胆固醇酯合成原料，而SREBP-1c主要调节脂肪酸的产生。这表明SREBP-1c/miR-185轴构成胆固醇代谢反馈通路，维持有力胆固醇和胆固醇酯的比值[17]。需要进一步的研究来了解miR-185在代谢性疾病中的生理作用。

3.2 胆固醇生物合成中的其他miRNA

在研究中抑制肝脏miR-122表达，导致小鼠血浆和肝脏的胆固醇和甘油三酯水平降低，表明miR-122对脂质和脂肪酸氧化基因有重要影响。后续研究还显示，减少miR-122可降低非人类灵长类游离胆固醇水平[18]。因此，miR-122被认为是潜在的新型降脂剂，提示它可能是一种治疗靶点。然而，另一项研究显示，在NASH患者中miR-122表达显著下调，抑制miR-122促进了人肝脏细胞中脂肪酸和胆固醇合成基因的表达[19]。这些相互矛盾的研究很可能是由于miR-122是肝脏中表达最高的miRNA之一，能够通过多种途径对正常肝功能产生重要影响。

NASH患者肝脏中miR-34a水平升高，这与SREBP-2增加有关[20]。研究发现，miR-34a可通过抑制SIRT1基因使SREBP-2稳定[21]。Lee等人发现，法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)通过激活转录抑制因子抑制miR-34a的表达，发挥调节SIRT1的功能。在非酒精性脂肪肝病中miR-34a和p53升高与SIRT1被抑制相关[22]。熊去氧胆酸是一种天然的胆汁酸，可通过激活胆汁酸受体FXR来降低脂毒性和NAFLD，Castro等人报道称这可能是FXR对miR-34a/SIRT1/p53轴的影响[23]。因此，miR-34a的上调可能促进肝脏脂肪变性的发生和进展，这表明抗miR-34a化合物能够有效治疗NAFLD和NASH。

最近研究显示，细胞胆固醇水平能够增加miR-223转录水平。在人肝细胞系中过表达的miR-223通过降低清道夫受体(SR-BI)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶(HMGCS1)活性，抑制胆固醇吸收和生物合成，并通过促进ABCA1基因表达提高胆固醇外流。此外，miR-223敲除小鼠通过诱导胆固醇生物合成基因(包括HMGCS1[24])，其血浆和肝脏表现出较高的胆固醇水平。这些结果表明，miR-223在调节全身胆固醇稳态中起关键作用。

4 miRNA对胆固醇逆转运的调节

4.1 胆固醇外流与miRNA

除了生物合成外，调控过量胆固醇外流对维持胆固醇稳态也是至关重要的。胆固醇转运体，ATP结合盒转运体A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)促进胆固醇外流至细胞外受体，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)颗粒。这个过程是胆固醇逆转运(RCT)的第一步，多余的胆固醇从外周细胞转运至肝脏，以便外排到胆汁和粪便中[25]。肝脏ABCA1失活会导致小鼠体内总HDL-c严重减少[26]。由于血浆HDL-C水平与心血管疾病呈负相关，因此ABCA1介导的胆固醇流出对于维持胆固醇动态平衡和防止动脉粥样硬化至关重要。最近的研究表明，几种miRNA靶向ABCA1，从而调节血浆HDL-C水平。其中，位于SREBP-2基因内含子内的miR-33a研究最为广泛。miR-33a和SREBP-2由于共同表达，协同调控胆固醇合成吸收和转运，以维持细胞胆固醇稳态[27]。此外，抑制miR-33能够显著增加肝脏ABCA1表达，进而增加小鼠体内循环HDL-c水平[28]。miR-33a在物种间高度保守，而人类位于SREBP1基因内含子中的miR-33b在啮齿动物中不存在。由于胰岛素抵抗引起的高胰岛素血症持续诱导SREBP-1c表达，人体在这种条件下miR-33b显著增加。这说明脂质生物合成调节异常和胆固醇流出可能导致高脂血症和心血管疾病。事实上，在胰岛素抵抗的非人类灵长类动物中miR-33b和SREBP-1c都显著增加[29]，通过miR-33拮抗作用调控miR-33靶基因(如ABCA1)，能够显著减低VLDL并增加HDL。尽管拮抗剂对葡萄糖稳态或胰岛素敏感性的作用尚未观察到，但这些结果表明miR-33a / b靶向治疗人类代谢疾病的治疗潜力。

肝X受体(Liver X receptor，LXR)是胆固醇代谢的主要调控因子，能够激活ABCA1、ABCG1等多种参与胆固醇逆转运的基因[30]。最近的一项研究证明了这点，在巨噬细胞中miR-26被氧化甾醇激活，能够靶向调控ABCA1和细胞内胆固醇转运蛋白[31]。相反，在类似的条件下，miR-144被LXR上调，并靶向ABCA1，表明在胆固醇流出过程中存在负反馈调节[32]。通过靶向LXR的3'UTR，肝脏miR-613参与LXR自动的反馈调节循环。此外，激活核受体FXR能够促进miR-144表达，同时控制胆汁酸合成、排出和运输的基因。miR-144还抑制肝脏ABCA1并降低血浆HDL-C水平。使用FXR激动剂可增加肝脏SR-BI的表达，促进肝脏对HDL-c的吸收，提示FXR诱导的miR-144是RCT过程中将胆固醇转化为胆汁的有效补充途径[33]。

4.2 HDL-c吸收与miRNA

肝脏和类固醇生成组织中SR-BI高度表达，能够促使HDL-c释放出胆固醇用于类固醇激素合成[34]。尽管血浆中低HDL-c水平是动脉粥样硬化的标志，但是提高HDL-c的益处仍存在争议。即便是在血浆HDL-c水平极低的情况下，小鼠肝脏SR-BI过表达同样能够降低动脉粥样硬化程度。功能性获得肝SR-BI可以选择性增加HDL-c吸收，并增加残留HDL颗粒的水平，这可能更有效的促进巨噬细胞中胆固醇外流，从而增加胆固醇外排至胆汁以及巨噬细胞胆固醇流出的总体速率。另一方面，敲除小鼠SR-BI基因导致肝脏分解HDL-c的代谢受损，HDL-c水平显著升高，巨噬细胞RCT速率降低，小鼠更易受APOE- 或LDLR-缺陷引发的动脉粥样硬化影响。这些结果表明，肝脏SR-BI可以影响RCT的总体速率，并且其表达的调控对于维持胆固醇稳态具有重要意义。最近研究表明，人肝细胞系中miR-185、miR-96和miR-223都能够抑制SR-BI和HDL-C摄取。在高脂饮食喂养APOE敲除小鼠中，其肝脏miR-96和miR-185表达显著下调，而SR-BI表达增加，提示这两种miRNA都可能调节血浆HDL-C水平和RCT[35]。此外，在高胆固醇喂养的小鼠肝脏中miR-96也显著下调，从而抑制SREBP-2降低胆固醇合成[36]。因此，通过抑制miR-96能够阻碍胆固醇合成并激活RCT，从而逆转动脉粥样硬化的进展。

5 展望

综上所述，miRNA通过调节胆固醇生物合成、脂蛋白摄取、CRT等系统地维持体内胆固醇稳态。因此，miRNA表达失调可能是引发胆固醇代谢紊乱的发病机制。事实上，研究已经证明，体内胆固醇稳态是通过转录因子和miRNA调节网络维持。SREBPs、LXR和FXR等细胞内甾醇传感器已被鉴定为直接调节miRNA转录的因子，通过参与反馈或前反馈调节回路维持胆固醇稳态。了解转录因子和miRNA调控网络将揭示机体复杂的稳态调节机制，对代谢性疾病的治疗提供坚实的理论支持。