脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的研究进展

潘盛盛 姜笃银

[摘要]脂肪干细胞具有多向分化能力和丰富的旁分泌功能，且因为其来源广泛、取材方便及组织损伤小等优点已成为细胞治疗和组织工程应用的理想工具。而面部年轻化一直是整形美容领域的热点，其中皮肤抗衰老又是重中之重，脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的作用吸引广大学者研究探讨。本文从离体实验、在体实验及临床应用三个方面综述脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的研究进展，以确定下一步研究的方向，为临床治疗提供更多可靠的依据。

[关键词]脂肪干细胞;皮肤抗衰老;光老化;自然老化;干细胞临床应用

[中图分类号]R339.3+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）11-0158-05

Abstract： Adipose-derived stem cells have multi-directional differentiation ability and rich paracrine function， and have become an ideal tool for cell therapy and tissue engineering because of their wide sources， convenient materials， and small tissue damage. The application of facial rejuvenation has always been a hot spot in the field of plastic surgery. Among them， skin anti-aging is the most important thing. The role of adipose-derived stem cells in skin anti-aging has attracted researchers to study. In this paper， the research progress of adipose-derived stem cells in skin anti-aging is reviewed from three aspects： in vitro experiment， in vivo experiment and clinical application， to determine the direction of further research and provide more reliable basis for clinical treatment.

Key words： adipose-derived stem cells; skin anti-aging; photo aging; natural aging; stem cell clinical application

自2001年Zuk等[1]首次从脂肪组织中分离、提取出脂肪干细胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）并命名以来，ADSCs因来源广泛、取材方便、组织损伤小、扩增迅速等优点已成为细胞治疗和组织工程应用的理想工具。在组织损伤修复、抗衰老及组织工程等方面均可发挥显著的作用。十多年来，ADSCs一直是干细胞研究领域的热点，其抗衰老方面的作用更是吸引研究者的目光，本文就ADSCs在皮肤抗衰老方面的研究和应用进展进行综述，讨论目前的研究现状、存在的问题以及未来研究可能的方向。

1  皮肤衰老的生物学特征

皮肤衰老是人整体衰老的一部分，身上各部位皮肤的衰老是不同步的，不同位置的皮肤首先本身厚度和性质不一样，其次长年累月受到的刺激也不一样，导致不同部位皮肤衰老的速度也会不一样。而面部皮肤因为比较薄且长期暴露在外，受到紫外線等因素的影响更多，往往是最容易衰老的部位。皮肤的表皮层、真皮层以及皮肤附属器的细胞和组织均会随着机体年龄的增长而发生相应改变，但最具有特征性的还是真皮层成分的变化。真皮层中富含胶原纤维、网状纤维、弹性纤维以及氨基多糖和蛋白多糖等基质，其中以胶原纤维的含量最为丰富，皮肤老化过程中，胶原纤维含量逐渐降低，真皮层厚度变薄，弹性纤维变性、减少，失去弹性、张力，从而导致皮肤衰老的一系列外在表现发生[2-3]，而真皮层成分变化的内因主要是成纤维细胞的衰老。

随着年龄的增长以及环境的侵害，在多种内源性（年龄、遗传、内分泌以及身心因素等）及外源性（物理化学刺激，主要是紫外线照射）因素的综合影响下，皮肤发生老化，而其中紫外线的影响又称光老化，在其中占据了极其重要的作用。紫外线致皮肤光老化的机制如下：①促进细胞凋亡：紫外线照射后皮肤细胞膜和细胞内部均会产生大量的活性氧（ROS），产生氧化压力，导致细胞凋亡，引起皮肤衰老;②损伤DNA：紫外线通过其诱发的ROS使DNA在相邻嘧啶碱基处产生环丁烷胞嘧啶二聚体和6-4光产物，这些突变与皮肤光老化形成皱纹有关;③降解胶原蛋白：紫外线照射皮肤后会诱导各种细胞表达相关的细胞炎性因子，其中表达量最高的是白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α，这些细胞炎性因子主要通过激活细胞核因子кB（NF-кB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等影响皮肤细胞胶原蛋白的合成;④抑制胶原蛋白的表达：被紫外线上调的异二聚体AP-1可通过转化生长因子-β/S mad信号通路下调胶原蛋白的表达，抑制胶原蛋白的合成;⑤染色体端粒缩短：紫外线照射皮肤产生大量ROS，机体无法清除部分的ROS会不断将三联鸟嘌呤氧化生成8-氧-7，8二羟基-2-脱氧鸟苷酸，从而缩短端粒的长度，导致皮肤细胞的老化[4]。

2  ADSCs的生物学特性

真空负压抽脂等技术可获得脂肪组织，脂肪组织进行组织破碎剔除纤维经胰酶消化后分离并在体外培养脂肪干细胞，进而采用流式细胞仪根据ADSCs细胞表面标志物分选、鉴定获得脂肪干细胞。目前研究结果表明，ADSCs并没有特异的标志物，脂肪干细胞大多位于血管周围区域。ADSCs形态类似成纤维细胞，抗原的表达与骨髓MSCs相似：CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD54、CD71、CD49、CD90、CD105、CD117。脂肪干细胞不表达造血标志物，如CD14、CD16、CD45、CD56、CD61、CD62、CD104、CD106，也不表达内皮细胞标志物CD31、CD144[5-6]。脂肪干细胞ADSCs和间充质干细胞MSCs免疫原性均较低，由于ADSCs 表达CD49d，而MSCs不表达CD49d，有学者用CD49d来区分ADSCs和MSCs。

ADSCs的生物学功能包括以下两个方面：①多向分化潜能：ADSCs具有向多种成体细胞分化的能力，如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞（包括骨骼肌、平滑肌以及心肌细胞）等[1];②具有旁分泌功能：ADSCs 可合成分泌多种类型细胞因子和成分，包括：①生长因子：有表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）等[7-9];②炎性相关因子：有干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1、IL-8、IL-9 等）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等[10-12];③细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等亚细胞颗粒：EVs 包含有来源于母细胞的RNA、DNA、蛋白质、脂质以及完整的细胞器等[13]。以上两个方面的生物学功能使得ADSCs能够增强细胞增殖的活力，提高受损细胞生命力，拮抗细胞凋亡，具有促进血管生成、组织修复的能力，还可以抑制组织炎症反应，在抗衰老等领域作用巨大。但具体机制复杂，作用机制方面仍未有明确的研究结果。

3  ADSCs的抗衰老实验

3.1 离体实验：ADSCs在细胞水平上具有改善衰老的人成纤维细胞各项功能的作用，能起到细胞水平的年轻化。Song SY[14]等让ADSCs与人老化成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）通过trans well小室共培养，在两类细胞没有直接接触的情况下，ADSCs通过旁分泌功能诱导光老化HDF，使其Ⅰ型胶原蛋白生成增加，并降低其MMP-1的产生和p16的表达，这说明ADSCs的旁分泌作用可能是其发挥生物学效应的重要手段，甚至是主要手段。该实验证明了ADSCs的旁分泌作用可以增加成纤维细胞胶原蛋白的合成，所以ADSCs在皮肤年轻化治疗中存在较大潜能。

除了细胞共培养之外，脂肪干细胞条件培养基（ADSCs-CM）也可以用来作用于成纤维细胞，可以改善人真皮成纤维细胞增殖活性，并且可以恢复UVB照射后HDF的功能，抵消UVB照射对成纤维细胞增殖的影响[15]。此外，ADSCs-CM预处理可以减少UVB诱导的细胞凋亡和衰老，但对内源性衰老因子诱导的细胞衰老没有明显影响。说明ADSCs-CM具有细胞水平抗衰老的作用，这也补充说明了ADSCs旁分泌功能在抗衰老方面的重要性。

除了间充质干细胞的旁分泌功能外，最近几年研究较多的是干细胞的外泌体在抗衰老中占有重要作用。Oh M[16]实验表明，人诱导多能干细胞（human-iPSC）来源的外泌体能显著降低衰老人成纤维细胞的SA-β-Gal和MMP-1/3的表达水平，并且可以使衰老HDF中的Ⅰ型胶原蛋白表达增加，提示干细胞来源的外泌体在皮肤衰老的治疗方面有一定的前景。Choi JS等[30]提取了人脂肪干细胞来源的细胞外囊泡（HASC-EVs），实验证实HASC-EVs能够显著抑制UVB照射诱导人成纤维细胞的MMP-1、-2、-3和-9的过表达，并增强了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型胶原的表达，从而达到皮肤抗衰老的目的。

3.2 动物实验：在动物实验方面，许多研究肯定了ADSCs对皮肤衰老的改善作用。Kim WS等[17]通过紫外线照射无毛小鼠背部皮肤造成皮肤光老化模型，并证明通过ADSCs的皮下注射可以增加老化皮肤的厚度和胶原蛋白含量，另外，UVB照射可以抑制HDF的增殖，而ADSCs-CM预处理的HDF可以逆转这一效果，说明ADSCs及其分泌的细胞因子的抗皱效果主要是通过减少UVB诱导的细胞凋亡和刺激HDF的胶原合成来实现的。Kim JH[18]通过在48周龄的老年雌性无毛小鼠皮下注射ADSCs，观察到皮肤胶原合成显著增加，并且皮肤厚度、胶原密度和成纤维细胞数量也增加。此外，前胶原Ⅰ型蛋白和mRNA表达增加，这导致真皮胶原密度增加，通过CD31和NG2免疫荧光染色观察到ADSCs皮下注射后的皮肤中血管生成增加。表明ADSCs皮下注射治疗可能有改善老化皮肤的作用，其作用主要通过刺激真皮成纤维细胞的胶原合成和增加血管生成来发挥作用。这一韩国团队在2019年又对实验做了扩展，他们在50周老龄裸鼠背部皮下分别注射脂肪组织、ADSCs和以上两种成分的混合物，结果三组实验都有阳性结果，且混合组的胶原增生明显超过脂肪组织和ADSCs单用组，皮肤厚度改善效果也最佳，可能与两种组织混合后干细胞总量增加有关，也从侧面反映ADSCs的抗衰老作用在一定范围内与干细胞数量呈正比[19]。

Chang H[20]的研究结果表明，ADSCs分泌了某种生长因子抑制了酪氨酸酶的活性，从而抑制黑色素形成，在体内实验中，ADSCs皮下注射可抑制UVB诱导的小鼠皮肤黑色素形成，说明ADSCs有一定的皮肤美白效果，但具体机制及安全性有待进一步研究。Jeong JH等[21]采用UVB照射诱导形成裸鼠光老化皮肤（模型），分别皮下注射人源ADSCs和成纤维细胞，实验结果显示两者都可以显著改善皮肤皱纹，ADSCs可以刺激胶原蛋白表达并降低基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，而成纤维细胞的注射对于胶原蛋白增加效果更佳明显，但它同时也增加了MMPs表达，所以ADSCs在紫外线诱导的光老化皮肤抗衰老方面效果明确。Xu Y[22]在文章中提到ADSCs-CM明显减轻了紫外线诱导光老化裸鼠皮肤的细胞抑制，并延缓了紫外线B（UVB）诱导的HDFs的衰老状态。用ADSC-CM处理的HDF表现出更高的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白分泌，并显著降低了MMP-1和MMP-3的分泌。TGF-β1中和抗体可部分降低恢复效果。研究结果表明，ADSCs对老化皮肤有改善作用，它们的作用主要是由于分泌因子，特别是TGF-β1，它刺激膠原蛋白的合成，减轻HDF中的胶原蛋白降解。Xu P等[23]使用紫外线B（UVB）辐射在BALB/c裸鼠上产生光老化皮肤模型，然后采用ADSCs和纳米脂肪（Nanofat）皮下注射治疗光老化皮肤，与对照组相比，ADSCs和Nanofat组增加了光老化皮肤的真皮厚度和新生血管形成，证实了脂肪干细胞在抗皮肤老化方面的作用。Gong MH[24]指出皮肤光老化主要是由皮肤干细胞的功能损耗引起的，皮肤干细胞生态位在维持干细胞存活和行为方面发挥着重要作用，他的团队假设UVB辐射通过改变皮肤干细胞壁生态位诱导皮肤光老化，并且转移的脂肪来源的干细胞（ADSCs）可以通过影响BMP信号传导途径和转分化为皮肤干细胞来改造生态位。皮肤干细胞标志物，如p63，整合素α6和CD34，在ADSCs中共表达，这表明ADSCs可以转分化为皮肤干细胞。实验发现UVB照射通过改变皮肤干细胞生态位导致典型的光老化迹象，并且Bmp4是毛囊干细胞中BMP信号传导的关键因素，ADSCs通过BMP4途径调节和转分化进入皮肤干细胞，重塑皮肤干细胞生态位，从而逆转了这些典型的光老化迹象。

以上较多的动物实验大多采用了脂肪干细胞皮下注射的实验方法，老化皮肤模型有自然衰老的老年小鼠，也有紫外线诱导的皮肤老化动物模型，主要的实验结果是观察皮肤胶原蛋白合成分泌的变化，皮肤厚度的变化，MMPs的表达变化，还有皮肤黑色素形成的变化，胶原蛋白分泌合成增加使得皮肤厚度增加，皱纹减少从而达到皮肤的年轻化，而黑色素形成减少则是达到皮肤美白的年轻化效果。有人研究表明，ADSCs起作用是因为恢复了皮肤干细胞生态位，从而逆转光老化的影响，但具体的作用机制和信号通路研究较少，是未来研究的方向，想要真正安全的临床应用，必须搞清楚具体的作用机制才行。

4  临床应用

虽然脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的机制并没有研究清楚，对于干细胞治疗的安全性、远期并发症等问题均没有确切的答案，但是对于美丽的追求让很多医生和就医者已经大胆地将脂肪干细胞用在了临床皮肤抗衰老的治疗上。Tonnard P[25]在临床上采用纳米脂肪（Nanofat）治疗67例面部皮肤老化的病例，用于改善眼周浅表皮肤皱纹、下睑的黑眼圈等问题，临床应用显示术后6个月患者皮肤质量有显著改善，且未见明显并发症，提示纳米脂注射可能成为皮肤抗衰老的一个重要治疗方法。

自体脂肪填充用于治疗面部软组织的缺损或不足已在临床开展很长时间，Bernardini FP[26]在临床上回顾了98例面部脂肪填充的患者，平均随访时间为6个月，通过大腿及腹部的抽脂获取富含活脂肪细胞和脂肪干细胞的脂肪颗粒，面部脂肪填充可有效矫正与年龄相关的脂肪萎缩，并且可以减少面部皱纹，改善皮肤质量，这说明在补充容量不足的同时，因为ADSCs的存在，自体脂肪组织的填充同时也起到了皮肤年轻化的作用。

各种脂肪组织来源的衍生物都含有ADSCs，包括本文之前提到的纳米脂肪，还有胶原酶处理后得到血管基质片段（stromal vascular fraction，SVF），还有体外培养分离提纯的ADSCs溶液，Charles-de-Sá L等[27]通过抽脂获得就医者脂肪组织，将部分脂肪组织体外处理获得SVF，另一部分脂肪组织体外消化培养获得脂肪间充质干细胞（ADSCs），并且扩增ADSCs至一定数量。将以上三种成分（脂肪组织颗粒、SVF、ADSCs）注射到患者皮下，随访结果表明，用脂肪组织颗粒、SVF或ADSCs治疗得到了类似的效果，即治疗效果没有显著差异，治疗效果是增加了真皮的厚度，减少皮肤皱纹，改善了肤质。但是对于此类治疗在临床上是否允许和恰当，大部分国家临床上都没有明确的明文规定，体外扩增过的细胞直接用于人体在安全性方面是否应更加慎重。Gennai A[28]在临床上通过微小孔径抽脂针（0.8mm、0.5mm、0.3mm）获得自体脂肪组织细小颗粒，分离提纯后用于口周及眼周皮下注射，治疗患者65例，改善皮肤老化疗效显著，主要表现也是口周、眼周皮肤细小皱纹的显著减少和肤质的改善，未见明显并发症。Liang ZJ等[29]比较了103例接受纳米脂肪（nanofat）和富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）真皮内注射（治疗组）的面部皮肤老化患者和128例接受透明质酸（HA）注射治疗的患者（对照组）的结果，显示在纳米脂肪和富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）聯合注射后，与对照注射HA相比，面部皮肤纹理得到更大程度的改善。Nanofat-PRF组的满意度更高，提示纳米脂肪和PRF可以作为皮肤老化治疗的可行方案。Yao Y[30]在回顾性单中心研究中随访了126例接受SVF凝胶移植的患者和78例接受常规脂肪注射治疗各种适应证的患者，结果所有患者均表现出面部增大和轮廓的改善。SVF凝胶组患者术后肿胀轻微，二次手术率低（10.9%）。SVF凝胶组中77.3%的患者对其结果满意（54.5%）或非常满意（22.8%）。相比之下，53.8%的传统脂肪注射患者满意（48.7%）或非常满意（5.1%）。此外，SVF-gel填充治疗显示出有效的抗皱和皮肤再生的年轻化效果，这一点要明显优于常规脂肪填充治疗。Amirkhani MA等[31]在美国FDA批准的临床试验中，采用自体SVF注射鼻唇沟，并评估疗效。共16例患者，收集每个患者的脂肪抽吸物，酶促处理，并测定细胞表面标记物，明确细胞成分。将最终产品注射到鼻唇沟皮下。在注射前和注射后6个月拍摄照片，并使用皮肤扫描仪（Visioline）和弹性测量装置（Cutometer）进行评估，使用多探头测量多个变量。结果显示治疗导致真皮密度和厚度显著增加。此外，6个月后皮肤色素沉着和黑色素生成的比色测定保持不变。然而，从皮肤表面水分蒸发的百分比显著降低。值得注意的是，注射1周后就无法检测到注射的细胞了，这表明SVF细胞成分的旁分泌机制起到主要作用，而不是注射的细胞本身分化并参与皮肤重建。

世界上很多国家的干细胞治疗已经在临床上开展，有些在正规的临床实验阶段，但是在整形美容行业，包括脂肪干细胞在内的各种干细胞治疗，在各种利益的驱使下有滥用的趋势。所以，对于干细胞治疗安全性和具体机制的研究迫在眉睫，只有在安全的前提下，加上有效的监管手段才能使干细胞治疗发挥功效且真正造福人类，而不是造成治疗滥用的灾难。

5  讨论

自体脂肪组织的移植技术已有近百年历史，1893年，德国医生Neuber首次报道块状脂肪移植，切取上臂小块脂肪填充面颊部凹陷，而Illouz在1986年提出颗粒脂肪移植理论后临床应用大大增加，1995年，Coleman发明了脂肪离心技术，革命性地提高了脂肪移植的存活率，直到2001年Zuk首次报道了脂肪干细胞，使得脂肪移植治疗从组织细胞水平深入到干细胞水平，Tonnard P[25]在2013年首次提出纳米脂肪的概念，实际上纳米脂肪治疗中起主要作用的就是ADSCs，所以，从2001年起自体脂肪干细胞就已经被用于临床，和自体脂肪移植一起治疗皮肤软组织的缺损、皮肤细小皱纹和黑眼圈等问题。各国医生对于临床疗效的报道多是肯定的，部分皮肤活检结果也证实皮肤厚度的变化，大体观察显示皮肤皱纹的改善，光泽度和皮肤弹性的增加，而且患者自我感觉也良好，未见报道任何严重的并发症。然而，临床自体脂肪隆胸术等大容量脂肪移植手术，已有较多并发症的报道，包括囊肿、钙化、结节及感染等，而且，此类并发症处理起来非常棘手，没有完美的解决办法，会留下永久的后遗症，这种情况也警示我们，在脂肪干细胞用于临床时，必须重视治疗的安全性，考虑远期并发症的可能，考虑干细胞治疗更多可能的风险，只有在安全性得到保证的前提下干细胞的治疗才能健康发展。

脂肪干細胞自2001年被发现并命名以来，各类研究证明其具有促进成纤维细胞合成胶原蛋白、分泌多种细胞因子、协助血管再生及抑制黑色素形成等抗衰老方面的作用，但仍需要解决以下问题：①注射后ADSCs的转归尚未明确，是分化成其他细胞，还是存活一定时间后自然凋亡，是否存在畸变，导致肿瘤形成可能，这对于干细胞治疗也是急需解决的安全问题;②ADSCs旁分泌功能强大，分泌的细胞因子、炎症因子、细胞外囊泡等诸多成分，功能复杂，作用机制没有研究清楚，如何按需调控各类细胞因子的分泌等问题也是未来急需解决的;③由于伦理、法律和安全性等多方面的考虑，脂肪干细胞治疗无法进行同种异体的应用，而ADSCs本身也存在老化问题，一些临床就医者年纪较大，而自体源性ADSCs存在抗衰老效果欠佳的可能，以至于同种异体干细胞或者其他治疗需求增加，通过细胞外囊泡等非细胞成分的研究是否可以进行大量生产和异体移植问题;④纳米脂肪和颗粒脂肪的获取不需要应用实验试剂，但脂肪干细胞的分离培养和增殖必须用到实验试剂，在体外扩增后的细胞如何保证临床应用的安全性，需要研究清楚并制定统一标准。这些问题需要大家在今后的工作中加以明确和解决。

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[收稿日期]2019-07-11

本文引用格式：潘盛盛，姜篤银.脂肪干细胞在皮肤抗衰老方面的研究进展[J].中国美容医学，2019，28（11）：158-162.