天然药物化学开放性实验教改初探

李芸芳 李竣

摘要：指出了天然药物化学开放性实验能激发学生对天然药物化学理论知识的学习兴趣，提升学生的实验技能和创新能力。以皱皮木瓜中多糖的提取及其单糖成分的测定为例，进行了开放性实验教学改革的研究。结果表明：通过让学生自主查阅文献，独立设计实验方案，对实验数据和结果进行分析讨论，将理论知识与实践相结合，不仅增强了学生的动手能力，还充分调动了学生的主观能动性，取得了良好的教学效果。

关键词：开放性实验;天然药物化学;多糖;皱皮木瓜

中图分类号：G642 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）17-0264-04

1引言

天然药物化学是高等院校药学专业的一门重要的专业基础课程，它是运用现代技术和方法研究天然药物化学成分的一门科学，研究内容主要包括天然产物化学成分的结构特点、理化性质、提取分离方法以及结构鉴定等。天然药物化学实验是天然药物化学教学中必不可少的环节，是使学生进一步理论联系实际，培养科研兴趣和实验能力的重要途径。

目前，天然药物化学实验大多采用传统的教学方式：指导教师通过讲座方式讲解实验内容、实验步骤和注意事项，学生再参照实验讲义按部就班地进行实验操作。传统教学模式的优点是：实验授课集中统一，便于教学管理，实验内容易于标准化;节约教学成本等。但这种模式也存在明显的不足之处：多以验证性实验为主，缺少探索性和趣味性;学生被动参与已拟定好的实验方案，从而缺少主观能动性;实验内容比较简单，大多只涉及基础操作，缺少挑战性和创新性。与传统实验教学模式不同，开放性实验是学生根据实验要求亲自参与设计实验方案，并验证方案可行性的自主性探究，具有以学生为中心、帮助学生自主学习、培养学生创新思维能力、调动学生学习积极性等优点，成为近年来实验教学改革的研究热点。

多糖化学成分是天然产物中具有药理活性的一个大家族，也是天然药物化学课程中的重点授课内容之一。多糖是由糖苷键结合的糖链，10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖具有多种药理活性，比如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、提高机体免疫力等作用。多糖的种类、结构和分子量大小对其药理作用有直接和间接的影响。本文以皱皮木瓜中多糖的提取和单糖的组成测定为例，进行了开放性实验项目的教学改革尝试。

2开放性实验的流程

在整个开放性实验中以学生为主体，指导教师起到引导和协助作用。图1所示为本实验项目的流程图：第一步，教师指定实验题目。在实验前，根据实验室的仪器设备和（或）实验材料等硬件条件给学生划定一定的实验范围。指导教师划定一个大概的范围后，可以避免题目太大，令学生无所适从，也可避免学生制定的实验方案因客观条件不足而无法开展。该项目指定的实验题目为“皱皮木瓜中多糖的提取和单糖成分测定”。第二步，由学生分析实验题目，领会实验要求。分析题目后，学生可明晰实验的研究对象是什么，实验要做哪些内容，实验的技术手段有没有限制等信息。比如上述实验题目的研究对象为“皱皮木瓜中的多糖”，并限定了实验内容，即“提取”和“分离”皱皮木瓜中的多糖并“测定”其中的单糖成分。此外，对采用的技术手段没有限制，给学生留下了灵活探索实验的余地和空间。第三步，由学生提出可能的实验方案。在学生领会了实验要求后，就要着手处理“怎么完成实验”这个总的问题，围绕这个总的问题又产生了一系列细节问题，比如“多糖有哪些提取方法？提取的原理是什么？哪种方法高效便捷？”、“多糖的分离手段有哪些？”、“多糖如何检测？检测手段有哪些？”等。这些问题可在教师的指导下，学生通过查阅资料和文献找到答案，然后由学生提出可能的实施方案和计划。在这个环节中，可充分调动学生的主观能动性，让学生带着疑问和好奇心开始学习和探索，激发学习兴趣。第四步，师生通过共同讨论确定实验方案。由于指导教师具备丰富的实验经验，在方案的确定上，需要通过讨论的方式协助学生确定实验方案，实验方案的选择主要考虑到实验硬件设施是否具备，实验材料是否易得，实验操作步骤是否复杂，实验方法是否可行等方面，综合考虑后确定实验方案，学生以撰写实验预习报告的形式制定实验计划。第五步，完善实验方案的细节，准备实验材料。假如方案里采用“膜分离”法分离和纯化多糖，那么计划用哪种孔径的滤膜进行实验？如果采用“高效液相色谱法”对多糖进行测定，检测波长选择多少纳米？可参考的流动相成分及配比是怎样的？诸如此类实验细节的确定为进入下一步实验环节提供了极强的操作性。第六步，按照已制定的实验方案，进行实验操作。本环节是整个实验的主体部分，指导教师需要给学生进行讲解和示范仪器设备的标准操作，以使学生掌握仪器的使用方法。其他实验步骤由学生自主独立完成。教师对实验进行监督和指导，重在启发和引导，培养学生动手能力。在实验过程中，要求学生有条理地记录实验条件、实验步骤、实验现象和实验结果等数据，培养严谨的实验习惯。第七步，实验结果的分析讨论和总结。该步对培养学生的科研思维能力非常重要。开放性实验重在培养学生探索研究的能力，对于实验结果的好坏并没有那么严格，即使实验结果不理想，教师鼓励学生对结果进行大胆的讨论和分析，协同学生一起找出原因和可能的解决方案，培养学生创造性解决问题的能力。最后由学生对实验做出书面总结，提交实验报告给指导老师批阅。

3实验安排

本实验计划学时为50个学时，学生每组5人。学生利用周一至周五课外时间以及周末在开放的本科教学基础实验室、光谱实验室以及色谱实验室进行实验。

4实验方案的设计与实施

本开放性实验的主要目的是讓学生了解和掌握多糖的提取分离和纯化方法以及多糖的检测方法，帮助学生巩固天然药物化学理论课上学到的基本知识和实验原理。通过该实验课程的学习，学生掌握1～2种多糖提取分离的常用方法，熟悉膜分离技术、柱层析技术等，对糖类成分的衍生化以及紫外分光光度法和高效液相色谱法等检测方法也有较为深入的了解和实践。在现有实验室提供的实验条件基础上，由学生自行设计实验方案和计划、完成实验内容，并写出实验报告。全面培养学生自主创新和动手能力，提高高等院校的人才培养质量。

4.1实验材料及仪器设备

实验所需皱皮木瓜为湖北长阳县皱皮木瓜干燥果实，经中南民族大学生科院刘虹副教授鉴定为蔷薇科木瓜属皱皮木瓜（C.speciosa Sweet Nakai），样品（No：201704）存放于中南民族大学药学院天然产物研究室。另需实验试剂有无水乙醇、三氟乙酸、二氯甲烷、色谱纯乙腈、氢氧化钠、碳酸氢钠、硼氢化钠、L-cysteinemethyl ester hydrochloride（L-半胱氨酸甲基酯）、0-tolyl isothiocyanate（邻苯甲异氰酸酯）、吡啶、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖等。

儀器设备有：氮吹仪（MTN-2800D型，上海鑫翁科学仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（101-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）、冷冻干燥机（FD-1B-50型，北京博医康实验仪器有限公司）、旋转蒸发仪（RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂）、水浴锅（WB-2000型，郑州长城科工贸有限公司）、循环真空泵（Z-III型，上海亚荣生化仪器厂）、紫外分光光度仪（UECl312028型，上海美普达仪器有限公司），电冰箱（BCD-228SDPW型，海尔有限公司）、电子精密天平（JAll003N型，郑州时代仪器设备有限公司）、大孔树脂（D-101型，天津普拉德生物科技有限公司）、超滤杯（MSC300型，上海摩速科学器材有限公司）、高效液相色谱仪（ULTIMATE 3000型，美国戴安公司）。

4.2皱皮木瓜中多糖的提取分离和纯化

4.2.1多糖的初步提取

经查阅资料后，学生了解到：在提取植物中的多糖时，现今的技术主要有水提法，酶解提取法，超声波提取法，以及微波提取法等。水提法是一种常见的提取办法，主要为称取一定的样品粉末后，通过在水中回流进行初步提取。该方法简便易行，遂采取水提回流法对皱皮木瓜中的多糖成分进行初步提取，提取方法如下：将新鲜的皱皮木瓜晒干，粉碎，过10目筛，用乙醇提取，干燥。称取90g皱皮木瓜粉末，按料液比1：10（质量体积比）加入超纯水，于95℃回流提取3次，每次1h，抽滤，合并提取液，加入无水乙醇至醇浓度为70%，于4℃条件下静置24h，4000r/min离心5min，将下层沉淀冷冻干燥，将冻干后固体溶解，并与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=5：1）按4：1充分混匀，震荡20rain，4000r/rain离心15min，收集上清液，除去多糖溶液层与有机溶液层间的白色胶状物，重复数次直至没有胶状物，悬蒸干燥，得到多糖粗提物。该粗提物溶液在200～800nm的波长范围内测量紫外吸收，对比除蛋白前的样品的吸收曲线。

4.2.2多糖的纯化

多糖的分离纯化有季铵盐沉淀法、离子交换色谱、纤维素柱色谱、凝胶柱色谱等方法，学生结合实验室现有条件，选择了膜分离法对粗糖物质进行分离纯化。

膜分离技术（Membrane Separation Technique）是利用天然或人工合成的具有选择透过性的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力对双组分或多组分混合的气体和液体进行分离，从而达到分离分级纯化浓缩目的的一门新兴的高效分离技术。学生通过查阅国内外文献，了解到膜分离技术的原理和发展概况，了解到膜分离有耗能小、分离效率高、无二次污染等优点。并调查了天然产物主要成分的相对分子量（表1），制定了膜分离实验的工艺路线图（图2）。

4.3单糖的组成及含量比的测定

4.3.1糖的衍生化反应

单糖在紫外下没有吸收，如要用紫外检测器来进行单糖种类鉴别，则需让糖发生衍生化反应连上生色团。粗糖用TFA水溶液水解，后与L一半胱氨酸甲酯水解糖的无水吡啶溶液反应，最后加入邻甲苯基异硫氰酸酯到混合物中，进一步加热反应得最终产物。反应原理如图3所示。

4.3.2高效液相色谱法检测

由于糖的衍生化反应使得糖分子连接上去了生色团，使最大吸收波长红移，故能在紫外波长280nm下显示吸收，可以采用高效液相色谱法进行检测。用D一阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖作为标准单糖来对比得出样品中的单糖种类构成及其含量比。

（1）实验步骤。

用混合标准品在紫外下进行全波段扫描找出最大吸收波长为250nm。取样品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖和D-半乳糖各10mg。并设置不加任何糖的空白对照。将样品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖和空白对照分别用4tool/L的TFA水溶液10mL于95℃水浴中水解3h，后减压蒸发下除去TFA。水解产物溶解于5mL无水吡啶，加入10mg L-半胱氨酸甲酯。混合液在水浴回流1.5h，后加入50uL邻甲苯基异硫氰酸酯到混合溶液中，60°C加热1h，反应后混合物用氮吹仪吹干，并用5mL二甲基亚砜溶解。将D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D一半乳糖各取0.5mL混合制成混合标准品，另将混合标准品中加入1.5mL二甲基亚砜使得其体积为3.5mL。

经上述处理的样品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，混合标准品和空白对照7组分别按下面按液相条件进样分析。

（2）液相条件。

色谱柱：Agilent HC-C18，4.6×250mm;流动相：25%CH3CN-H20（含1‰TFA）;柱温30℃;流速：0.8mL/min检测波长：280nm;进样体积：5uL。

5实验结果的讨论与分析

5.1多糖的提取率

学生根据实验数据分析得知此皱皮木瓜样品的多糖的含量仅为2.16%。在具体实验中，经Sevag法除蛋白，膜分离后，样品剩余0.80g，则得出多糖的提取率为41.15%。讨论分析提取率偏低的可能原因为：用Sevag法时，把蛋白层剔除时有部分多糖与蛋白一起剔除，这个过程应该是多糖损失的最主要步骤，此外，实验中综合考虑后，选取规格是3500的超滤膜对多糖进一步纯化，这就使分子量低于3500内的多糖成分流出透析袋，最后留下的是分子量在3500以上的大分子糖类，减少了多糖的含量。这些都是造成多糖提取率偏低的原因。

5.2单糖成分检测结果

图5是对混合标准品和样品粗糖衍生化反应后产物的HPLC分析图。图5A中，D一阿拉伯糖（RT=29.80min），D-葡萄糖（RT=24.98min），D-木糖（RT=28.29min），D-半乳糖（RT=21.80min）。图6B中能匹配上混合标准品峰的有两个，对应的保留时间分别为RT=21.81min，RT=27.52min，即为D-半乳糖和D-木糖。

混合标准品由2mg/mL D-阿拉伯糖，2mg/mL D一葡萄糖，2mg/mL D-木糖和2mg/mLD-半乳糖分别取0.5mL，并加二甲基亚砜稀释至3.5mL所得，故混标中，D-木糖和D-半乳糖的浓度都为0.3mg/mL。液相分析时，每次进样量为5UL，故每次进样的质量为1.5×10^-3mg。

设进样的5uL样品中D一半乳糖的质量为M1，其物质量为N1。D-木糖的质量为M2，其物质量为N1。根据表1和表2数据和单糖质量根据公式：标准峰面积/多糖水解液中对应单糖峰面积一标准单糖质量/多糖水解液中对应单糖质量，可计算得到多糖中D一半乳糖和D一木糖的质量。根据这两种单糖的分子量，可计算出皱皮木瓜中这两种单糖的摩尔比为1：4.8。

讨论和分析：通过高效液相色谱法分析皱皮木瓜多糖的单糖组成至少为D-半乳糖，D-木糖两种，通过图5中B可知，样品中还有其他未知的峰，可能还有其他单糖的存在，皱皮木瓜多糖的单糖组成可在此实验基础之上通过使用更多的单糖标准品对比，获得更详尽的单糖组成信息。

6结语

开放性实验教学是教学改革的重要举措，培养学生的主体性是实验教学改革实现的有效途径，也是提高学生实验技能、培养学生综合能力的有力保障，应充分发挥学生主体性作用在高校人才培养中的重要作用。本文以“皱皮木瓜中多糖的提取和单糖成分测定”为例，尝试了教学模式的改革，通过开放性实验教学，大大提高了学生的学习兴趣，培养了学生主动学习的能力，对所学的天然药物化学知识有了感性直观的理解和认识，同时，由于本课程中的紫外分光光度法和高效液相色谱法是药物分析实验课程的内容，同学们将所学的药物分析课程的知识应用到了天然药物化学实验上，增强了药学专业知识的交叉渗透，使学生可以融汇贯通，学以致用。