贯叶连翘不定根提取工艺优化及其对酪氨酸酶活性的影响

孙浩丁， 郝悦君， 安晓丽， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

贯叶连翘(Hypericumperforatum)属金丝桃科，金丝桃属多年生草本植物，又称贯叶金丝桃、千层楼，多产于我国陕西、河北、河南省，生长于山区河从草地、灌丛和山坡中，是一种常见的药用植物[1]。贯叶连翘性平，味辛、苦，具有清热解毒，调经止血的功效。人们常将贯叶连翘鲜品捣碎或干品研末敷到伤口，以此治创伤出血、伤口肿毒和烧烫伤等。德国将贯叶连翘用作抗抑郁症药已有100多年的历史，英国、俄罗斯也有大面积栽培，并广泛应用于临床。贯叶连翘的有效成分为金丝桃素和伪金丝桃素，这2种植物次生代谢产物具有抗菌、止血、退热和治疗灼伤，外伤出血等作用，是很多人熟悉的民间药草。作为纯天然植物药，贯叶连翘的提取物在治疗轻中度抑郁症，联合治疗失眠、消化系统疾病、良性阵发性位置性眩晕、酒精依赖综合征，焦虑障碍、心血管神经症等方面具有优良的效果，而且耐受群体多，安全性高，值得临床推广应用[2]。

黑色素是一种生物色素，是分布于自然界的色素之一，由酪氨酸或3，4-二羟苯丙氨经过一系列的化学反应合成，黑色素通常以聚合的方式存在于动物、植物与原生生物中。黑色素是动物皮肤和毛发中存在的一种黑色或褐色的色素，由黑色素细胞生成并且储存于其中。且正是由于黑色素的存在，才使皮肤有了颜色。黑色素其实是一种氨基酸衍生物，它们存在于皮肤底层的细胞之间，被称作色素母细胞，色素母细胞能够分泌麦拉宁色素，当紫外线照射到皮肤上时，刺激麦拉宁色素，激活酪氨酸酶的活性，来保护我们的皮肤细胞。多巴经酪氨酸氧化，释放出黑色素。黑色素经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层形成雀斑、晒斑、黑斑等形状[3]。

酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互变酶在黑色素的产生中起到了催化的作用。由于无法控制酪氨酸，所以只能通过控制催化剂来防止黑色素的产生。在这其中，酪氨酸酶的催化作用是反应产生的第1步，它是黑色素合成的关键酶。 所以控制酪氨酸酶的活性，是美白护理的重点。酪氨酸酶是一种黑色素合成的限速酶，其活性与黑色素合成的数量有关。现如今，关于酪氨酸酶活性抑制剂的相关研究越来越多，为攻克色素细胞性肿瘤、黄褐斑等色素疾病提供帮助。天然植物效果显著且毒副作用低，现在已经成为化妆品的热点研发对象[4]。

近年来，贯叶连翘越来越多地应用于医疗保健行业，临床上在联合治疗失眠、酒精依赖综合征、良性阵发性位置性眩晕、心血管神经症、消化系统疾病等方面，具有肯定的疗效，而且安全性和耐受性好，林芝等[5]研究发现，贯叶连翘提取物可作为治疗轻、中度抑郁症及焦虑症的纯中药制剂；余爱农等[6]在研究贯叶连翘时发现贯叶连翘中含有的金丝桃素具有抗病毒、抗抑郁等作用。国内外还完成了抗艾滋病的Ⅱ期临床试验，治疗恶性神经胶质瘤的临床研究也在进行中。然而，至今为止尚未发现国内外用其提取物抑制黑色素生成的研究，且由于提取工艺的不同，其提取物中活性成分含量会有所差异，因此，该试验以贯叶连翘不定根为材料，研究不同提取条件的提取物抑制酪氨酸酶活性的能力，筛选出最佳的提取工艺，为深入研究贯叶连翘抑制黑色素生成及美白护肤相关产品的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验使用于晓坤[7]的方法获得贯叶连翘不定根。

1.2 方法

1.2.1 不定根不同溶剂提取物对酪氨酸酶活性的影响

称取烘干的不定根干粉1 g置于50 mL容量瓶中，之后分别加入80%乙醇，80%甲醇和水，物料比设置为1∶30(g∶mL)。应用超声提取法，在50 ℃和40 kHz的频率(KH3200DE数控超声波清洗器，昆山禾创有限公司，中国)下提取1 h，共3次，并将提取液过滤，之后使用旋转蒸发仪(R2002D,上海申顺生物科技有限公司，中国)将所得滤液真空浓缩至膏状，将其置于烘干箱(YHW-1103远红外鼓风干燥箱，天津市华北实验仪器有限公司，中国)中44 ℃下干燥至恒重后，测定3种溶剂提取的贯叶连翘不定根提取物对酪氨酸酶活性的影响。

1.2.2 不定根提取物浓度对酪氨酸酶活性的影响

将贯叶连翘不定根粉末1 g浸泡在80%的甲醇中，研究在不同提取时间、温度、次数以及甲醇浓度条件下贯叶连翘不定根提取物对酪氨酸酶活性的影响。按照1.2.1方法制备提取物，取干燥好的提取物分别以2，4，6，8，10，12 mg溶于10 mL磷酸盐缓冲液中，测定不同浓度的提取物对酪氨酸酶活性的影响，确定提取物的最佳浓度。

1.2.3 提取时间、提取温度和提取次数及甲醇浓度对酪氨酸酶活性的影响

1) 单因素试验 ①提取时间：将提取时间设置为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，在50 ℃，料液比为1∶30(g∶mL)的提取条件下提取3次，其他提取物提取方法同1.2.1；②提取温度：在提取温度试验中，使用酪氨酸酶活性较低的时间作为提取时间，将提取温度设置为30，40，50，60，70 ℃，其他提取物制备方法同1.2.1；③提取次数：以提取温度试验中酪氨酸酶活性较低的温度及时间作为提取条件，将提取次数分别设置为1，2，3，4，5次，其他提取物制备方法同1.2.1；④甲醇浓度：以提取次数试验中酪氨酸酶活性较低的次数、温度、时间为提取条件，将甲醇浓度设置为20%，40%，60%，80%，100%，其他提取物制备方法同1.2.1。

2) 正交试验设计 依据单因素试验的结果，选择提取时间、提取温度、提取次数以及甲醇浓度等4个因素，以贯叶连翘不定根提取物对酪氨酸酶活性影响作为指标，设定4因素3水平L9(34)正交试验(表1)，确定最佳的提取工艺条件。

表1 正交试验因素水平

根据正交试验中最佳提取条件的结果，对其进行验证试验，重复3次，确定该条件是否具有稳定性。

1.2.4 酪氨酸酶活性的测定方法

参照蒋晓龙等[8]的方法测定酪氨酸酶活性，用酶标仪(iMark酶标仪，Bio-Rad，美国)检测贯叶连翘不定根提取物对酪氨酸酶活性的影响。按照表2精确吸取贯叶连翘不定根提取物溶液、磷酸盐缓冲溶液(pH值为6.8)和1 mmol/L L-多巴(SIGMA公司，美国)溶液于96孔检测板相邻的4个凹槽A1、A2、A3、A4中，在室温下孵化10 min后，加入50 U/mL的蘑菇酪氨酸酶(SIGMA公司，美国)溶液，5 min后用酶标仪在450 nm处测吸光值(OD)，并计算出对酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率/%=1-[(ODA1-ODA2)/(ODA3-ODA4)]×100%

表2 反应液的组成

1.2.5 软件分析及数据整理

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析试验数据，用邓肯氏新复极差法作对比，显著水平为0.05，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的贯叶连翘不定根甲醇提取物对酪氨酸酶活性的影响

提取物浓度从0.2 mg/mL 提高到0.8 mg/mL 时，对酪氨酸酶的抑制率明显升高，达到71.5%，当提取物浓度从0.8 mg/mL 提高到1.2 mg/mL 时，对酪氨酸酶的抑制率趋于平缓，虽有所升高，但已无显著差异(表3)。因此，综合上述，将0.8 mg/mL作为贯叶连翘不定根提取物的最适浓度。通过对甲醇、乙醇和水提取物对酪氨酸酶活性抑制率测定的结果，发现甲醇提取物对酪氨酸酶活性抑制率(71.5%)高于水提(39%)及乙醇提取物(42%)。测定酪氨酸酶活性通常使用生物酶学法或细胞学法，该试验采用生物酶学法进行测定，因此排除甲醇毒性的因素，后续试验都选择甲醇作为提取溶剂。

表3 贯叶连翘不定根提取物浓度对酪氨酸酶活性的影响

注：不同字母表示0.05水平上差异显著。

2.2 提取时间、温度、次数及甲醇浓度对酪氨酸酶活性的影响

2.2.1 贯叶连翘不定根提取物的提取时间对酪氨酸酶活性的影响

提取时间从0.5 h上升到2.5 h过程中，酪氨酸酶活性的抑制能力虽然持续增高，由68%上升到72.1%(图1)，但各水平之间抑制率没有明显差异。因此，为了节约试验时间，后续试验采用0.5 h来制备提取物。

图1 贯叶连翘不定根的提取时间对酪氨酸酶活性的影响

2.2.2 贯叶连翘不定根的提取温度对酪氨酸酶活性的影响

当提取温度从30 ℃上升到60 ℃时，酪氨酸酶活性的抑制率呈上升趋势，且在60 ℃提取物对酪氨酸酶活性抑制能力达到最高，能够达到78.8%。当提取温度继续升高时，酪氨酸酶活性的抑制率开始降低(图2)。

图2 贯叶连翘不定根的提取温度对酪氨酸酶活性的影响

2.2.3 贯叶连翘不定根的提取次数对酪氨酸酶活性的影响

在提取4次以内的范围内，提取物对酪氨酸酶抑制能力随着提取次数的增加而升高，而再继续增加提取次数后，抑制能力开始降低。重复提取4次时，酪氨酸酶活性的抑制率达到79.5%，因此，选择的提取次数为4次(图3)。

图3 贯叶连翘不定根的提取次数对酪氨酸酶活性的影响

2.2.4 不同浓度甲醇提取的贯叶连翘不定根对酪氨酸酶活性的影响

提取物对酪氨酸酶抑制能力随着甲醇含量的增加而升高，而在使用80%的甲醇提取时，酪氨酸酶抑制率达到最高值80.1%。当继续使用更高浓度的甲醇时，抑制率开始降低，因此，最适宜的甲醇浓度为80%(图4)。

图4 不同浓度甲醇提取的贯叶 连翘不定根对酪氨酸酶活性的影响

2.3 正交试验

依据上述单因素试验结果，设定L9(34)正交试验方案，对提取时间(A)、提取温度(B)、提取次数(C)和甲醇含量(D)等4个因素进行不同组合，探究了这些组合对酪氨酸酶活性的影响，正交试验方案及结果见表4。

表4 正交试验方案及结果

注：不同字母表示0.05水平上差异显著。

表4中的第6组，即当提取时间为1 h、提取温度为70 ℃、提取3次、甲醇浓度为80%时，对酪氨酸酶活性的抑制率最高，达到83%，高于其他组合。对极值R进行分析的结果，R值由大到小的顺序排列为提取时间(A)>提取温度(B)>提取次数(C)>甲醇含量(D)，说明不同提取条件对酪氨酸酶活性的影响不同，其中影响最大的是提取时间，其次是提取温度、提取次数和甲醇含量。分别计算出各因素水平对酪氨酸酶活性的平均值K，经分析发现提取时间(A)、提取次数(C)和甲醇含量(D)中K2值最大，提取温度(B)中K3值最大。综上所述,最适宜的工艺条件为A2B3C2D2,即提取时间为1 h、提取温度为70 ℃、提取4次、甲醇浓度为80%。与蒋晓龙的东北刺人参的最佳提取工艺(提取时间1.5 h，料液比1∶20，提取温度70 ℃，提取次数3次)相比较，最优提取条件有所不同，其原因可能是与植物种类直接存在差异，并且抑制酪氨酸酶活性的有效成分也有所不同。

为确定最优的提取工艺是否具有稳定性，对正交试验中得到最佳提取条件(A2B3C2D2)进行3次重复验证试验，结果发现酪氨酸酶活性的抑制率均值为90.2%，高于正交试验中抑制率最高的第6组(83%)。验证试验结果的相对标准偏差(RSD)值较小，为0.6%(表5)。

表5 验证试验结果 Table 5 Verification of test results

3 讨论与结论

由于近年来对贯叶连翘的大量采收，导致其野生植物资源逐渐稀少，直接影响了对贯叶连翘的开发与利用。而通过生物反应器可以大量培养植物细胞、组织或器官，目前已应用于贯叶连翘[9]、人参[10]以及瓦松[11]等多种植物的愈伤组织和不定根培养当中。通过这种方法培养的贯叶连翘不定根也已作为制药、保健品及美白产品开发的原材料。当前市场上，相关的美白产品大多数是通过抑制酪氨酸酶活性来达到美白的效果。目前如儿茶酚、熊果苷等多种化学合成的酪氨酸酶抑制剂被广泛应用在美白产品的生产中，然而，对于这些化学合成物质的毒性、副作用、安全性则需要严格把控[12]。相比较而言，植物的提取物安全性高，其美白、护肤的功效也更加显著。研究表明，构树[13]、侧柏叶[14]、人参酚酸[15]、无患子[16]、白附子提取物[17]和蒺藜提取物[18]等能够有效地抑制酪氨酸酶活性，达到美白的效果。

现如今，超声提取法被广泛应用于植物有效成分的提取，黄晓辉等[19]研究了水葫芦黄酮的提取工艺，其最佳工艺条件为：超声温度45 ℃ ，料液比1∶45(g∶mL) ，超声时间35 min ，提取pH值8。在该工艺条件下，测得黄酮提取率4.51%；李良玉等[20]对苦荞麦壳黄铜的提取工艺进行优化，结果显示：超声功率379 W，液料比33.5∶1(mL∶g)，超声温度61.2 ℃，超声时间29.7 min，苦荞麦壳总黄酮的得率达到(3.66±0.2)%；计红芳等[21]对柠檬蜡伞多糖的提取工艺进行研究，试验确定柠檬蜡伞多糖的最佳提取条件为：液料比40∶1(mL∶g)、提取温度85 ℃、提取时间90 min，提取2次；在此条件下，多糖含量达4.412 g/100 g；李兰等[22]对怀山药活性多糖提取条件优化后的结果显示，怀山药活性多糖最佳的提取条件为：浸提时间3 h，浸提料液比为1∶10(g∶mL)，浸提次数3次。利用最佳的提取条件做重复试验，可使多糖平均得率达到17.18%。

植物中有效成分的提取方法对酪氨酸酶活性的影响很大，越来越多的研究人员通过提取条件的改善，确定最佳的提取工艺，但由于植物种类不同，所适合的最佳提取条件也会有所不同。本试验中贯叶连翘不定根甲醇提取物在提取时间1 h，提取温度70 ℃ ，提取次数4次 ，甲醇含量80%的条件下，对酪氨酸酶活性抑制能力最强，为90.2%。因此，贯叶连翘不定根可作为美白化妆品产业的一种较好的原材料，本研究对贯叶连翘资源的开发及利用提供了参考依据。