白细胞介素-35在溃疡性结肠炎中的作用

潘治平，崔焌辉，沈锋

（1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德医院肛肠外科，浙江 杭州 310012）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是炎症性肠病的一种亚型，其特征在于肠道的慢性炎症。近几十年来，UC的发病率在世界范围内有所增加，特别是在发展中国家[1]。由2个亚基Epstein-Barr病毒诱导基因3（epstein-barr virus induced gene 3, EBI3）和白细胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）p35亚基的异二聚化组成的白细胞介素-35（Interleukin-35, IL-35）具有通过调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）和调节性B细胞（regulatory B cells, Bregs）介导的免疫抑制作用，使其成为治疗UC的候选者[2]。本文深入讨论IL-35的表达和生物学功能，并为将来的临床试验和药物开发提供理论依据。

1 IL-35的组成

IL-12家族由IL-12、白细胞介素-23（Interleukin-23, IL-23）、白细胞介素 -27（Interleukin-27, IL-27）和IL-35组成，属于造血细胞因子的I型家族（见表1）。与大多数具有单体、同源二聚体或同源三聚体功能的细胞因子不同，IL-12细胞因子是少数几种具有异构体功能的细胞因子之一[3]。IL-12相关细胞因子是由α链（p19、p28或p35）和β链（p40或Ebi3）组成的异二聚体蛋白质。α链具有4个α螺旋束结构，典型的细胞因子有IL-6、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子，而β链与可溶性细胞因子受体链具有同源性。因此，IL-12是p35（IL-12α）/p40（IL-12β）异二聚体，IL-23是p19（IL-23α）/p40（IL-12β）异二聚体，IL-27是p28（IL-27α）/EBI3异二聚体。IL-35是由p35α亚基和EBI3β亚基组成的异源二聚体。Ebi3仅含有3个蛋氨酸和4个半胱氨酸残基，而IL-12 p35含有10个蛋氨酸和7个半胱氨酸残基，据推测两者之间不存在二硫键[4]。IL-12家族细胞因子的受体也共享亚基。IL-35受体由IL-12Rβ2/gp130异二聚体或同源二聚体组成。IL-12Rβ2是IL-12受体的组成部分，而gp130是多种细胞因子受体的组成部分，包括IL-6、IL-11、IL-30、肿瘤抑制因子M和白细胞抑制因子[5]。

表1 IL-12细胞因子家族的结构和特征

2 IL-35的表达和分泌

EBI3与IL-12的p35亚基结合形成EBI3/p35异二聚体IL-35，EBI3与p35的体内关联最初在人胎盘提取物中得到证实。p35基因在许多类型的细胞中以低水平组成型表达，因此几乎无所不在[6]。IL-35由小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs组成型表达[7]。BARDEL等[8]发现在非刺激的人体胸腺、脾、淋巴结、扁桃体、肠和血液Treg细胞中未检测到IL-35。有研究还发现IL-35在IL-35诱导的CD4+Treg细胞群中表达，定义为iTr35[9]。除了CD4+Tregs之外，IL-35还被证明在前列腺癌患者的CD8+Treg细胞群中表达，并介导抗原特异性抑制[10]。IL-35的表达在体内和体外都能有效地调节CD4+和CD8+T细胞的应答。

与其他成员不同，IL-35不是由抗原呈递细胞产生，如巨噬细胞、单核细胞和树突细胞，其主要由CD4+Foxp3+Tregs分泌[7]。Tregs对IL-35的最大表达和分泌需要与效应性T细胞（effective T cell, Teff）接触，这增强了Tregs的抑制能力[11]。此外，在较小程度上活化的B细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞也是IL-35的来源[12]。IL-35对干扰素-γ有分泌作用，可作为Toll样受体3和4的激动剂。IL-35还可诱导常规T细胞转化为CD4+Foxp3-分泌iTr35，这种正反馈级联放大效应极大地抑制了多种效应细胞和细胞因子的作用。LI等[13]发现只有在脂多糖或炎症细胞因子的热原扰动下，才能在单核细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞中检测到IL-35 mRNA的存在，揭示了IL-35只在炎症刺激反应中分泌。

3 IL-35的信号转导

IL-35不符合大多数细胞因子特有的典型高亲和力及低亲和力受体复合物信号转导模式[14]。IL-35的信号通路似乎与IL-12、IL-27的信号通路重叠。这可以通过其与IL-12Rβ2的同二聚体（即IL-12Rβ2∶IL-12Rβ2和gp130∶gp130）或异二聚体，以及分别由IL-12R和IL-27受体（即gp130∶IL-12Rβ2和IL-12Rβ2∶wsx-1）组成的gp130的非优先结合来证明信号的部署[15]。gp130受体是包括IL-6、IL-11和IL-27在内的多种细胞因子受体的组成部分。另一方面，IL-12Rβ2是一种严格意义上的IL-12细胞因子家族受体[16]。IL-35与包含gp130和/或IL-12Rβ2的同二聚体或异二聚体结合后开始信号转导。受体结合后，信号转导通过Janus激酶/信号转导子和转录激活子进行。信号转导子和转录激活子 1（signal transducers and transcriptional activators 1,STAT1）的磷酸化在IL-35与gp130受体结合后发生，而STAT4的磷酸化在IL-35与IL-12Rβ2结合后发生。将IL-35与缺乏STAT1或STAT4的T细胞共孵育，发现其抑制能力显著降低，因此，STAT1和STAT4的协同作用对于IL-35介导的抑制至关重要。

COLLISON等[15]结果表明，与全功能IL-12Rβ2/gp130异二聚体受体复合物的信号传导相比，通过同源二聚体受体对传递的信号是由STAT1和STAT4调节的，从而导致IL-35抑制活性的部分丧失。通过同二聚体受体介导的信号转导在抑制Teff细胞增殖的同时不能诱导其转化为iTr35，原因是信号转导途径中只有1支（包括同源二聚体）是开启的。相反，WU等[17]报道由IL-12Rβ2∶gp130组成的同源二聚体受体对的信号转导既能介导iTr35的诱导，又能介导Teff的抑制。有证据表明，IL-12Rβ2能被B细胞和树突状细胞表达，影响IL-35在免疫系统中的生物活性[18]。SHEN等[2]的研究说明IL-35在B细胞中的信号转导是通过IL-12Rβ2∶wsx-1组成的异二聚体受体复合体来调节的。

4 IL-35的免疫抑制作用

IL-35活性相关的主要抑制机制是抑制T细胞增殖和效应功能。有关IL-35活性的基础研究利用白细胞介素-12 p35亚基-/-和Ebi3-/-小鼠，发现缺乏IL-35表达的CD4+Tregs抑制T细胞增殖的能力显著降低，这一发现在许多模型中被重复[9，18-19]。重组 IL-35（recombinant IL-35, rIL-35） 抑 制 T细 胞反应的能力也在研究中得到了清楚的说明，其可以降低T细胞增殖和T细胞因子的表达这些研究由于难以生成活性的IL-35异二聚体形式而变得有些复杂[20]。IL-35的抑制活性不仅限于CD4+Tregs，因为CD8+CTLA-4+Tregs也以非接触IL-35依赖的方式抑制自体T细胞的增殖[10]。

虽然对IL-35机制的研究集中在抑制CD4+和CD8+T细胞增殖的能力上，但是IL-35也在抑制辅助性T细胞17（helper T cell 17, Th17）反应中发挥作用。表达IL-35的Tregs可抑制CD4+T细胞向Th17效应细胞的分化，而缺乏EBI3的小鼠IL-17的产生明显增加[21]。有研究发现，rIL-35降低了Th17的分化及Th17细胞的功能[22]。除了其对Th17免疫的影响外，一份报告甚至提出rIL-35可以导致抗体滴度降低[20]。虽然体外研究已经清楚地表明IL-35能够直接作用于效应T细胞，但IL-35抑制抗体反应的能力可能表明IL-35也能够作用于其他细胞群，也可能有助于体液免疫的辅助性T细胞应答的抑制[22]。研究进一步发现体外免疫也被rIL-35抑制，其诱导人B细胞转化为产生IL-35和IL-10的Bregs[2]。

最近，LI等[23]首次提出IL-35及其IL-12细胞因子家族成员是具有抗炎功能的稳态相关分子模式和具有促炎功能的危险相关分子模式。IL-35不是特异性地与一种受体结合，而是松散地具有一种模式特征，被不同的IL-12家族受体杂乱地识别，这些家族受体为稳态相关分子模式受体。IL-35作为稳态相关分子模式结合同二聚体和异二聚体受体的潜在优势可能包括以下几个方面：①IL-35在不同的炎症过程中，无论哪种受体在不同的细胞中表达和发挥作用，均可抑制广泛的炎症反应和免疫反应；②IL-35阻断和干扰IL-6、IL-12和IL-27受体信号转导；③IL-35以高度敏感和有效的方式维持全身和组织稳态。

5 IL-35与溃疡性结肠炎的相关性

UC以大肠黏膜和黏膜下层的溃疡和炎症为特征，被认为与过度侵袭性T细胞介导的对肠道微生物群的免疫反应有关，由环境触发因素引起和重新激活[24]。目前，UC的药物治疗包括糖皮质激素，免疫抑制剂和新兴的生物疗法（抗TNF-α单克隆抗体）。然而，仍有一大批患有难治性或复发性疾病的患者无法忍受目前可用的药物治疗。对UC患者肠道中免疫炎症通路的分析表明，组织损伤是由免疫细胞和非免疫细胞之间复杂而动态的相互作用所驱动，其中细胞因子是这种相互作用的关键介质[25]。白细胞介素是相关细胞因子谱的关键成分，因此被确定为潜在的未来治疗靶点。

LI等[26]首次证明活动性的UC患者血清IL-35水平显著低于健康对照组，与UC活动性成反比。TAKAHASHI等[27]报道Tregs频率在UC活动期降低，与疾病活动呈负相关，结果表明Tregs的缺乏与溃疡性结肠炎的进展有关，Tregs是IL-35的主要来源，因此可导致外周血中IL-35的减少。在结肠黏膜中，IL-35的过度表达和分泌增强可能在UC的炎症过程中起一定作用。与正常结肠相比，Treg细胞在结肠炎区域的固有层中高度浸润。通过浸润免疫细胞递送的IL-35增加，以对抗UC中的黏膜炎症。

巨噬细胞是体内重要的吞噬和抗原提呈细胞，根据表型可分为M1（经典激活）和M2（替代激活）2种极化类型。M1型巨噬细胞介导了结肠炎的炎症反应，而M2型巨噬细胞抑制炎症、维持肠道免疫平衡。与正常人相比，UC患者的结肠组织表现为巨噬细胞高浸润。随着病情的发展，巨噬细胞浸润率也逐渐升高。WANG等[28]研究表明，IL-35重组蛋白可以显著减少大肠组织中巨噬细胞的数量。卢战军等[29]研究发现IL-35可能通过调控SHIP1的表达，抑制M1型巨噬细胞极化，缓解肠道炎症。此外，免疫荧光染色显示，IL-35重组蛋白能明显抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润。Tregs组成性地存在于肠黏膜中，通过抑制效应T细胞的增殖来抑制免疫反应。有研究证实IL-35可以诱导Tregs的产生，Tregs的比例在IL-35重组蛋白处理后显著上调[30]。

肠道炎症主要由Th1、Th2和Th17细胞的免疫反应介导。这些细胞与炎症黏膜中的其他细胞之间的相互作用由多种细胞因子介导，包括促炎和抗炎细胞因子。IL-10能拮抗Th1细胞因子，稳定肠黏膜免疫平衡，是一种重要的抗炎细胞因子，对UC的发生起到保护作用[31]。近期研究表明IL-10在IL-35重组蛋白处理后上调；相比之下，血清和结直肠组织中的几种促炎细胞因子，包括IL-6、IL-17和TNF-α均下降[31]。尽管炎症细胞因子和免疫细胞之间存在复杂的相互作用网络，但IL-35在Th17细胞与Tregs的平衡中起着重要作用。一方面，IL-35能够诱导iTr35细胞产生，更多的iTr35细胞进一步分泌更多的IL-35。另一方面，IL-35通过Tregs的扩张和IL-10的分泌有效地抑制Th1和Th17细胞。此外，IL-10在抑制巨噬细胞时可进一步降低IL-6水平。总之，IL-35可通过调节炎症相关细胞因子的分泌来诱导抗炎环境的产生。

针对肿瘤坏死因子的药物已被认为是缓解严重UC的首选药物[32]，然而，也提高了不良事件的风险，如感染、狼疮样自身免疫反应和超敏反应。因此，需要一种靶向结肠的新型给药方法，副作用较少，局部药物浓度较高。最近ZHANG等[33]首次构建了表达IL-35的靶向改造大肠杆菌（大肠杆菌/IL-35），并研究口服大肠杆菌/IL-35对小鼠模型中实验性结肠炎的治疗效果，结果显示IL-35治疗组的疾病活动指数显著降低，中性粒细胞和CD3+细胞在结肠内浸润更少；此外，大肠杆菌/IL-35治疗组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结的CD4+IL-17A+Th17细胞减少，CD4+CD25+Foxp3+Tregs升高，结肠和血清IL-10、IL-35水平升高，IL-6水平降低。该研究表明，大肠杆菌/IL-35作为一种新型口服IL-35递送系统减轻了结肠组织的炎症损伤[33]。

UC与Treg/Th17的失衡密切相关，Tregs上调和/或Th17抑制可以对UC提供积极干预。IL-35在体外促进Tregs的抑制功能和在体内控制内环境稳定的增殖中起重要作用，同时IL-35能抑制Th17的分化和功能。因此，增加IL-35的表达可用于控制UC中黏膜炎症的范围，为UC的治疗提供新的靶点。而利用靶向改造大肠杆菌编码免疫调节细胞因子的基因治疗方法，可能提供了一种潜在的途径[33]。IL-35水平可高度指示UC中Treg稳定性的程度。血清IL-35水平降低可能是体内抗炎活性不足的表现，有望成为监测UC疾病活动的生物标志物[26]。

综上所述，笔者发现12年来IL-35的作用仍然知之甚少。IL-35是一种免疫抑制细胞因子，是自身免疫和传染病期间免疫力的关键调节因子。IL-35主要通过减少巨噬细胞、CD4+T和CD8+T细胞的浸润，以及提高Tregs的比例来减缓结肠炎的发病。此外，IL-35可以通过调节多种炎症相关因子来达到抑制炎症的作用。IL-35可能是临床上重要的诊断指标，然而，作为溃疡性结肠炎的合适治疗策略，需要进一步研究IL-35在UC免疫和炎症调节网络中的确切作用。