大肠癌中自噬相关蛋白与JAK2/STAT3信号通路的相关性

（嘉兴市第二医院 肿瘤外科，浙江 嘉兴 314000）

细胞自噬是真核生物普遍存在的一种自稳机制，在细胞自我保护、胚胎发育及生物生存等机体正常生理机制中发挥关键作用。自噬失调与肿瘤的发生、发展关系密切[1]，近年来大量研究表明自噬参与大肠癌的发生、发展，但其具体机制尚不明确[2-3]。JAK2/STAT3信号通路在大肠癌的增殖、凋亡及侵袭转移等过程中均发挥重要作用[4]。本文通过研究自噬相关蛋白与JAK2/STAT3信号通路在大肠癌中的相关性，为探索大肠癌的发病机制提供新的实验数据和理论基础。

1 资料与方法

1.1 资料

收集2015年7月-2016年12月嘉兴市第二医院肿瘤外科大肠癌患者手术切除标本93例。根据2010年WHO消化系统肿瘤分类标准[5]，患者均经病理学专家检查确认。其中，男性51例，女性42例；年龄25～83岁，平均（62.18±6.39）岁；肿瘤直径≥5 cm 59例，＜5 cm 34例；发病部位：结肠38例，直肠55例；肿瘤分化程度：高分化29例，中分化46例，低分化18例；组织类型：管状腺癌78例，黏液腺癌15例；浸润深度：黏膜及黏膜下层3例，肌层11例，外膜79例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移68例。大肠癌标本和癌旁组织标本取材分别在癌灶中央的非坏死区和远离癌组织5 cm的区域，经过4%多聚甲醛溶液固定24 h，采用免疫组织化学法检测。患者均为首次发现，患者术前未行任何放化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗。

1.2 试剂

兔抗人LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3均购自美国Cell Signal Technology公司，免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法检测采取免疫组织化学法检测LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3在大肠癌组织，以及癌旁组织中的表达，具体步骤如下：脱蜡水化，梯度酒精水化，3%过氧化氢H202孵育15 min，PBS冲洗3次，放入pH值6.0的拘椽酸钠缓冲液中，在100℃高压锅内1 min暴露抗原，PBS冲洗3次，添加适量聚合物辅助剂孵育20 min，PBS冲洗3次，DAB试剂盒显色，充分清洗，苏木精复染，自来水冲洗，盐酸酒精分化1 s，自来水冲洗，氨水返蓝，自来水冲洗，二甲苯处理3次，中性树胶封片。

1.3.2 结果判定LC3、p62及p-JAK2阳性着色部位位于细胞质，在每张切片上随机选取10个高倍视野（400倍），每个视野计数100个细胞，根据细胞染色强度及阳性细胞比例进行结果判断。着色强度：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；阳性细胞比例≤5%计0分，＞5%～25%计1分，＞25%～50%计2分，＞50%～75%计3分，＞75%计4分。将着色强度与阳性细胞比例评分乘积作为最终评分结果，≥4分为阳性表达，＜4分为阴性表达。p-STAT3阳性着色位于细胞核，以细胞核呈棕黄色为阳性标志，计算阳性细胞占肿瘤细胞百分比，将阳性细胞百分比≥50%作为高表达组，＜50%作为低表达组。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，相关分析用Spearman法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中LC3、p62的表达及其与大肠癌临床病理特征的关系

LC3和p62主要表达于细胞质中，为黄褐色或棕褐色颗粒（见图1），大肠癌与癌旁组织中LC3阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌高于癌旁组织。不同分化程度LC3阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有无淋巴结转移患者LC3阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移高于无淋巴结转移。见表1、2。

大肠癌与癌旁组织p62阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌组织低于癌旁组织。不同分化程度患者p62阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高、中分化高于低分化。有无淋巴结转移患者p62阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移低于无淋巴结转移。LC3、p62表达情况与患者性别、年龄、肿瘤直径及肿瘤部位无关（P＞0.05）。见 1、2。

图1 大肠癌及其癌旁组织中自噬相关蛋白和STAT3信号通路的表达 （免疫组织化学×400）

2.2 不同组织中JAK/STAT3通路相关分子的表达及其与大肠癌临床病理特征的关系

p-JAK2阳性表达染色主要定位于细胞浆（见图1）。大肠癌与癌旁组织p-JAK2阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌高于癌旁组织。p-JAK2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤直径和肿瘤部位无关（P＞0.05）。不同分化程度患者p-JAK2阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有无淋巴结转移患者p-JAK2阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移高于无淋巴结转移。见表1、2。

p-STAT3阳性表达染色主要定位于细胞核和细胞浆（见图1）。大肠癌与癌旁组织中p-STAT3阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌高于癌旁组织。p-STAT3的表达与患者的年龄、性别、肿瘤直径和肿瘤部位无关（P＞0.05）。不同分化程度p-JAK2阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高中分化低于低分化。有无淋巴结转移患者p-JAK2阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移高于无淋巴结转移。见表2。

表1 大肠癌与癌旁组织的LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3阳性率比较 [n =93，例（%）]

表2 不同因素大肠癌患者LC3、p62、p-JAK2和p-STAT3阳性率比较 例（%）

续表2

2.3 自噬相关蛋白与JAK2/STAT3信号通路的相关性

大肠癌中自噬相关蛋白LC3的表达与p-JAK2、p-STAT3的表达均呈正相关（rs=0.315和0.295，P=0.001和0.003）， 而p62的表达 与p-JAK2、p-STAT3的表达均呈负相关（rs=-0.320和-0.326，均P=0.001）。见表3。

表3 LC3、p62与p-JAK2、p-STAT3蛋白表达的相关性 例

3 讨论

自噬与多种疾病的发生、发展有关，其在肿瘤发展中的作用也越来越受到重视。微管相关蛋白1轻链3作为哺乳动物自噬体形成，以及胞浆到空泡靶向囊泡所必需的一种蛋白，常用来作为自噬体的标志性蛋白之一，微管相关蛋白1轻链3表达情况可在某些程度上反映自噬体数量[6]。自噬过程中，p62蛋白与待降解蛋白结合，并包裹到自噬体中，然后被特异性降解，因此p62蛋白的表达与自噬活性呈负相关。本研究结果显示大肠癌中LC3阳性表达率明显高于癌旁组织，而p62在大肠癌中的阳性表达率明显低于癌旁组织，且随着癌组织的分化程度越低，LC3阳性表达升高而p62阳性表达率降低。表明大肠癌组织中的自噬水平明显高于癌旁组织，且自噬水平与癌组织的分化程度和淋巴结转移有关，组织分化程度越低，自噬水平越高；且出现淋巴结转移患者自噬水平明显高于无淋巴结转移，这与文献报道的研究结果相一致[7]。

JAK2-STAT3信号通路在细胞增殖、生长、分化及凋亡过程中发挥重要作用，是一条与多种肿瘤的形成和发展关系密切的信号通路[8-12]。有研究表明，JAK2/STAT3信号通路在大肠癌的发生、发展中发挥着重要作用[13]。本研究发现，p-JAK2和p-STAT3在大肠癌中的阳性表达率高于癌旁组织，且与组织分化程度与淋巴结转移有关，p-JAK2和p-STAT3在高、中分化癌组织中的阳性表达率低于低分化癌组织，在有淋巴结转移癌组织中的阳性表达率高于无淋巴结转移的癌组织，表明JAK2-STAT3信号通路的高表达可能与大肠癌的恶性程度有关，这些结果与文献报道相一致[14]。

多项研究结果表明，JAK2/STAT3信号通路与癌细胞的凋亡密切相关[15-17]。多种肿瘤中发现，敲除JAK2可诱导细胞凋亡和自噬[18-20]。因此推测，大肠癌中自噬相关蛋白与JAK2/STAT3信号通路可能存在关联。本研究通过相关性分析发现，大肠癌组织中LC3的表达与p-JAK2和p-STAT3的表达均呈正相关，p62的表达与p-JAK2和p-STAT3的表达均呈负相关。提示大肠癌中自噬活性的升高与JAK2/STAT3信号通路密切相关。

综上所述，在大肠癌的发生、发展中，自噬相关蛋白与JAK2/STAT3信号通路通过内在的分子机制相互协调转化，使细胞向恶性方向发展。因此，对两者的深入研究有利于揭示大肠癌发生、发展过程中的分子机制，为早期发现、治疗大肠癌提供新的理论依据。后续研究需进一步扩大样本量，以获得更为可靠的研究数据。