向日葵三个谷胱甘肽-S-转移酶GST基因的克隆及表达模式分析

凌云鹤,李 静,景 兵,李春莲，肖恩时,王中华

(西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100)

谷胱甘肽-S-转移酶是通过清除各种胁迫诱导的活性氧来保护细胞的重要酶。谷胱甘肽(GSH)在该酶的催化下能将有毒物质转化为无害或低毒物质。Wilce等在1960 年于动物中第1次发现GST，这些酶对解除药物毒性具有重要作用[1]。1970年，Edwards等[2]在玉米中发现可与氯-S-三嗪阿特拉津除草剂结合的GST，它可以保护作物免遭损害。此后在小麦、马铃薯、大麦、拟南芥、烟草、甘蔗、矮松、大豆、石竹、鹰嘴豆、高粱等多种植物中克隆到了许多GST基因或其类似序列[3]。

研究发现，GST基因在植物的所有组织中都有表达，但GST同工酶种类及其表达水平在不同物种、不同组织及不同细胞中是不同的。各种胁迫条件，如病原微生物，除草剂，重金属离子，高盐，高温，低温，机械损伤等都能诱导出几种特定的GST基因表达[3]，其在植物抵抗生物和非生物胁迫中发挥着非常重要的作用。王丽萍等[4]将盐地碱蓬的GST基因转入拟南芥中过量表达减轻了盐胁迫、干旱胁迫对其生长的危害[5-6]。Galle等[7]鉴定TaGSTU1B和TaGSTF6基因在小麦抵抗干旱胁迫下起作用。朱守晶等[8]通过试验发现BnGR1基因的表达量随Cd2+浓度的增加而逐渐升高，推测该基因增强了苎麻对镉胁迫的适应性；Kumar、Binh等[9-10]认为过量表达水稻OsGSTL2基因可以增强拟南芥对重金属、干旱及高盐胁迫的抗性；Agrawal等[11]研究发现OsGST2显著响应稻瘟病菌的诱导，表明该基因在水稻防御反应中具有重要作用。安秀红等[12]发现苹果中的MdGSTU1被NaCl和PEG 诱导表达。范玉洁等[13]研究发现，橡胶树HbGSTU1表达受低温等因素调控，但对ABA处理的应答不明显。

向日葵(HelianthusannuusL.)属于菊科(Compositae)，是重要的油料作物，具有高产、高油、耐干旱、耐瘠薄、易栽培、适应性广等特点，是世界上最重要的大田作物之一，在中国已有四百多年的栽培历史[14]。其叶片繁茂宽大、根系发达，既可以减少地面的水分蒸发，又能吸收大量的深层水、促使耕层可溶性盐类下移，从而降低地表盐分含量，从而使向日葵可以在盐碱地中正常的生长、繁育[15-19]。目前国内外对向日葵抗逆分子机制的研究尚处起步阶段，分离鉴定其抗性相关基因，对培育抗逆转基因向日葵品种具有非常重要的意义。本研究在本实验室所做的向日葵逆境转录组基础上，运用RT-PCR和RACE技术克隆了3个盐胁迫响应GST基因的cDNA序列，构建系统进化树并进行分析，利用实时定量PCR技术研究这3个基因在向日葵不同组织部位和不同胁迫条件下的表达，为进一步研究该基因在向日葵抗性中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料及其处理

供试材料为向日葵品种Sk02R，来源于西北农林科技大学农学院保存的种质资源。采用土培盆栽试验，营养钵大小为7 cm×7 cm，每盆装入200 g湿润培养土。每盆精选籽粒饱满均匀且无病虫害的种子8粒，播后正常供应水分，幼苗两叶一心时间苗，每盆定苗2株。

在向日葵六叶一心时期，分别进行200 mmol·L-1的氯化钠盐胁迫处理、100 μmol·L-1的ABA喷施于向日葵叶片处理、4℃冷胁迫处理、43℃热胁迫处理，将向日葵置于光温培养箱(24℃，16 h光照；21℃ 8 h黑暗)中培养，取未处理、处理1、3、6、12、24、48 h的向日葵叶片以及未处理向日葵的根、幼叶、成熟叶、茎、幼茎、苞叶等部位，在实验室里用液氮处理后将其放入-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 向日葵基因组DNA的提取 用CTAB法对向日葵幼叶进行基因组DNA的提取。

1.2.2 RNA 提取与cDNA第一链合成 利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA，使用生物光度计检测RNA的浓度与纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，按照Gen-Star试剂盒说明反转录得到第一链cDNA，在-20℃冰箱中保存。

1.2.3GST基因的克隆 根据向日葵转录组测序所发现的GST基因，设计克隆引物(TSINGKE公司合成)。基因序列设计引物如下：

表1 引物序列

以之前从向日葵中提取的cDNA为材料，使用KOD酶进行PCR扩增。

(1)PCR反应体系如下：

(2)PCR反应程序：

PCR程序结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察结果，判断是否成功扩增出所需要的目的片段。按照DNA回收纯化试剂盒的步骤进行目的片段的回收。将pMDTM18-T Vector载体与回收到的目的片段进行连接，使用CaCl2方法制备E.coli DH5α感受态，菌落PCR验证后送生工生物工程股份有限公司(上海)进行测序。然后通过SEQMAN分析测序结果，与HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27进行序列比对，确定克隆序列是否正确。

1.2.4 生物信息学分析 利用MEGA6软件构建进化系统发育树；基因结构分析用Gene Structure Display Server (GSDS)软件。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析 根据已克隆的向日葵GST的cDNA序列分析结果，利用Primer primier5.0设计荧光定量引物(见表2)，参照杜方等[20]的步骤进行荧光定量PCR，进行向日葵不同部位不同胁迫下GST基因表达分析，每个试验设置3个重复。所得数据采用Excel进行平均数统计， 2-△△CT法[21]计算相对表达量，以SPSS软件进行方差分析，LSD多重比较，利用Excel绘图。

表2 PCR定量荧光引物

2 结果与分析

2.1 GST基因的克隆及进化分析

通过对拟南芥和水稻的GST家族蛋白序列以及HanXRQChr04g0127901、HanXRQChr06g0177581、HanXRQChr10g0316331氨基酸序列ClustalX 2.1进行多序列比对，再用MEGA 5.0 的neighbor-joining (NJ)(Bootstrap 1000)算法构建系统进化树(如图1)。由系统进化树可知，这3个基因属于Tau型，将这3个基因分别命名为HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27。

以向日葵幼叶RNA经过反转录形成的cDNA以及提取的DNA做模板，在其保守区内设计特异引物，进行基因扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2，根据已知的序列以及电泳出现的特异扩增带，其大小与预测长度基本相符，说明我们成功克隆了向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因。

2.2 GST基因结构分析

由生物信息学分析得知：HaGSTU26基因DNA序列全长为1674bp，CDS(编码蛋白序列)长666bp，编码221个氨基酸，由2个外显子和1个内含子组成；HaGSTU8基因DNA序列全长为2271bp，CDS长654bp，编码217个氨基酸，由2个外显子和1个内含子组成；HaGSTU27基因DNA序列全长为663bp，CDS长663bp，编码220个氨基酸由1个外显子组成，基因结构示意图如图3。

图1 部分物种GST氨基酸序列的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the GST from several plant species

2.3 向日葵不同组织中GST基因的表达

HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因在向日葵根、幼茎、幼叶、成熟叶、苞叶和成熟茎中均有表达且表达量不同，见图4。HaGSTU26基因在向日葵根中相对表达量最高，其次是幼叶、苞叶、成熟叶、幼茎和成熟茎，HaGSTU8基因在苞叶中相对表达量最高，其次是根、成熟叶、幼茎、幼叶和成熟茎。HaGSTU27基因在根中相对表达量最高，其次是幼叶、苞叶、成熟叶、幼茎和成熟茎。这3个基因在成熟茎中较其他组织相对表达量均最少。

2.4 向日葵在不同胁迫条件下GST基因的表达

2.4.1 盐胁迫下GST基因的表达模式分析 由图5可知，向日葵幼苗受到盐胁迫后，HaGSTU26基因表达量随时间的延长先增加，在胁迫6 h后稍有下调，但在胁迫12 h后相对表达量最高，此后逐渐降低。HaGSTU8基因表达量随时间的延长先增加，在胁迫3 h后相对表达量最高，此后逐渐降低。HaGSTU27基因的表达量随时间的延长先增加，在胁迫3 h后相对表达量最高，此后逐渐降低。说明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表达对盐胁迫有响应。

2.4.2 ABA处理下GST基因的表达模式分析 向日葵幼苗经ABA处理后(图6)，HaGSTU26基因表达量随时间的延长呈现先增加后降低的趋势，处理12 h后相对表达量急剧增加并且达到最高值。HaGSTU8基因表达量随时间的延长呈现逐渐增加的趋势，处理24 h后相对表达量最高。HaGSTU27基因的表达量随时间的延长呈现先增加后降低的趋势，处理12 h后相对表达量最高。说明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表达对ABA处理有响应。

注 Note：M：2000 marker.图2 向日葵HaGSTU26, HaGSTU8,HaGSTU27基因的克隆Fig.2 Cloning of sunflower HaGSTU26, HaGSTU8 and HaGSTU27 genes

图3 向日葵HaGSTU26,HaGSTU8,HaGSTU27基因结构Fig.3 Gene structure of sunflower HaGSTU26, HaGSTU8 and HaGSTU27 genes

2.4.3 冷胁迫下GST基因的表达模式分析 向日葵幼苗受到冷胁迫后(图7)，HaGSTU26基因的相对表达量随时间的延长呈现先增加随后降低最后又升高的趋势，胁迫3 h后相对表达量最高。HaGSTU8基因相对表达量随时间的延长呈现逐渐减少的趋势。HaGSTU27基因的相对表达量随时间的延长整体呈现增加的趋势，胁迫24 h后相对表达量最高。说明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表达对冷胁迫有响应，其中HaGSTU26和HaGSTU27基因上调表达，HaGSTU8基因下调表达。

2.4.4 热胁迫下GST基因的表达模式分析 向日葵幼苗受到热胁迫后(图8)，HaGSTU26基因的相对表达量随时间的延长整体呈现增加的趋势，HaGSTU8基因相对表达量随时间的延长呈现先增加后降低然后又增加的趋势，胁迫3 h后表达量上升，此后又下降到未胁迫时的水平，最后在胁迫24 h后，相对表达量达到最高值。HaGSTU27基因的相对表达量随时间的延长整体呈现增加的趋势，这3个基因均在热胁迫24 h后表达量最高。说明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表达对热胁迫有响应。

图4 向日葵不同组织中GST基因的相对表达量Fig.4 Relative expression of GST gene in different sunflowertissues

图5 盐胁迫下GST基因的相对表达量Fig.5 Relative expression of GST gene under salt stress

图6 ABA处理后GST基因的相对表达量Fig.6 Relative expression of GST gene after ABA treatment

图7 冷胁迫下GST基因的相对表达量Fig.7 Relative expression of GST gene under cold stress

图8 热胁迫下GST基因的相对表达量Fig.8 Relative expression of GST gene under heat stress

3 讨 论

盐害是农业中最重要的非生物胁迫之一，土壤中过量的盐分积累，会减少土壤水势，细胞膨压，破坏土壤和植物中营养物质的平衡而使植物生长缓慢，并引起毒性效应[22]。GST在植物抵抗逆境胁迫中起到重要作用，它被分为Phi、Tau、Theta、Zeta、Lambda型、脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbatereductases，DHARs)和TCHQD7类，其中Phi型和Tau型是植物所特有的[19, 23-24]，但目前有关向日葵GST基因的克隆还鲜少报道。本研究从向日葵品种Sk02R成功克隆了HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27这3个基因，通过进一步的系统进化树分析，本研究发现向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27的氨基酸序列与来自拟南芥、水稻中的Tau类GST基因聚为一个类群，亲缘关系最近，表明这3个基因属于Tau类GST家族成员。

有许多研究表明，GST基因在植物不同组织中表达量不同。马立功等[25]从向日葵中克隆到1个HaGSTU1基因，在根、茎、叶、花、和种子中均能检测到该基因的表达，且在叶中相对表达量最高，在茎中的表达量最低。安秀红等[12]从苹果中克隆MdGSTU1基因，其在根、茎、叶、花、果等部位中均有表达，根中的相对表达量最高。乔光等[26]发现，木豆的CcGST1基因在其根、茎、叶中均有表达，但根中的表达水平最高。青花菜中的GST基因在根、叶、荚中的表达丰度较高，花蕾中表达丰度较低，存在明显的组织特异性[27]。本研究对向日葵不同器官GST基因表达量进行分析，发现其在向日葵根、幼茎、幼叶、成熟叶、苞叶和成熟茎中均有表达，HaGSTU26、HaGSTU27在根中的表达量最高，HaGSTU8在苞叶中的表达量最高，HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27的表达量均在成熟茎中最低，这与上述文献研究结果类似，故推测这3个GST基因在向日葵的生长发育及抗逆中具有重要作用。

GST家族基因在多数植物中都参与了逆境胁迫的应答，这在许多参考文献中可以看到。An等[28]研究表明，苜蓿的MsGST(KM044312)在ABA、盐、干旱、冷和热等各种逆境胁迫下，其表达水平均上调。水稻在经50 μmol·L-1Cd处理7 d后，根系的GST活性明显增强[29]。胡桃楸JrGSTTau1基因经6℃、8℃、10℃、12℃以及16℃处理的菌株中，其GST、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性表达量均上调，而H2O2、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)均下调[30]。苹果MdGSTU1在经150 mmol.L-1NaCl处理后，在1 h时表达量达到最高值[12]。不同非生物胁迫(干旱、盐、低温)可显著诱导山羊草中AEGTA43277、AEGTA19581、AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578基因在根和叶片中的表达[31]。本试验研究结果表明，HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27这3个基因都可以被盐、冷、热等非生物胁迫以及ABA处理诱导表达，因此我们推测该基因在抵抗非生物胁迫中具有重要的作用。本研究仅对这3个GST基因进行了初步的表达分析，要想全面了解其在向日葵抗逆中的作用机制，有待进一步深入研究。