干旱胁迫下不同中间砧对“岳冠”苹果叶片光合特性及叶绿素荧光特性的影响

里程辉，刘 志，王 宏，于年文，王 杰，张秀美，李宏建，宋 哲

(辽宁省果树科学研究所，辽宁 营口 115009)

果树受到干旱胁迫时叶片气孔关闭，叶肉细胞损伤，这些生理反应导致植物光合速率下降。通过光合相关指标的变化趋势，也可以反映植物在干旱胁迫下生长受到的影响程度。同样，嫁接也对果树的光合作用产生影响，并且不同砧穗组合间影响不同。随着光合作用的深入研究，利用叶绿素荧光动力学方法可以快速、灵敏、无损伤地研究和探测各种逆境对植物光合生理的影响[1]，能够提供植物光合器官结构和功能的丰富信息[2]，特别是快速叶绿素荧光诱导动力学曲线分析方法的出现，能够快速、无损地分析逆境胁迫下PSⅡ反应中心能量捕获及 PSⅡ供体侧和受体侧电子传递变化[3]。前人利用该技术已在果树[4-7]、蔬菜[8]、玉米[9]等多种逆境研究中取得了一定结果。

近几年，苹果的矮化密植栽培方式因其产量高、品质优、早果早产、生产管理方便等优点，已成为我国苹果产业的发展方向和趋势。“岳冠”(寒富×岳帅)是由辽宁省果树科学研究所杂交选育的苹果新品种，该品种在冷凉地区发展比“寒富”更有优势；“辽砧2号”(助列涅特×M9，引自辽宁省果树科学研究所)、“GM256”(红海棠×M9，引自吉林省农业科学院果树研究所)、“77-34”(M9×小黄海棠，引自辽宁省果树科学研究所)是3种适合在冷凉地区栽培的矮化、半矮化砧木，以山定子为基砧，这3种砧木为中间砧与“岳冠”嫁接后亲和性良好。苹果生长不仅受砧穗组合的影响，也受环境因素影响，我国大多数果园立地条件较差，干旱是限制其高产优质的重要因子之一。因此，为了弄清干旱胁迫对不同砧穗组合苹果的作用机制，本试验系统研究了干旱胁迫条件下不同中间砧对“岳冠”盆栽树叶片光合特性、叶绿素荧光诱导动力学参数及动力学曲线(OJIP)的影响，同时对部分光系统Ⅰ(PSⅠ)的关键参数进行探讨，旨在全面反映在干旱胁迫条件下各砧穗组合对“岳冠”光合性能的影响，筛选适宜干旱地区栽培的砧穗组合，以期为生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于2017年6月至7月在沈阳农业大学果树栽培与生理生态试验基地(123°341′E，41°491′N)进行。供试的盆栽苗接穗品种为“岳冠”，基砧为山定子(Malusbaccata)，中间砧分别为辽砧2号、GM256和77-34，基砧接口粗度1.5 cm左右，嫁接高度为10 cm，中间砧段长25 cm，2016年3月采用舌接方式进行嫁接，包括岳冠/辽砧2号/山定子(YG/L2/Mb)、岳冠/GM256/山定子(YG/GM256/Mb)、岳冠/77-34/山定子(YG/77-34/Mb)和岳冠/山定子(YG/Mb)4种砧穗组合；嫁接后在温室内进行常规管理，管理水平一致。试验用盆采用口径30 cm，高30 cm的异形耐老化塑料营养钵；营养土为园土棕壤，质地为粘壤土，有机质含量14.25 g·kg-1，碱解氮78.39 mg·kg-1，速效磷25.82 mg·kg-1，速效钾178.21 mg·kg-1，pH值6.8。每种砧穗组合选择长势一致的2 a生盆栽苗20株，为保证在同一时间测定各参数，根据之前所做盆栽土壤含水量预试验，从2017年6月20日开始，分时段进行处理，处理前充分灌水，即所需水量为土壤水分饱和状态的持水量。设置以下处理：正常供水为对照(CK)，轻度干旱胁迫(LD)，中度干旱胁迫(MD)和重度干旱胁迫(HD)，土壤含水量分别为田间持水量的75%，55%，40%和30%。2017年7月16日各处理达到处理指标后，统一进行叶片光合参数和叶绿素荧光参数测定，测定位置在中心干延长头当年新稍第6～8片成熟无病虫叶，测定后将叶片带回实验室，清洗并用吸水纸吸干，用于叶绿素含量的测定，设5次生物学重复。

1.2 叶片光合参数的测定

叶片叶绿素含量测定参考李合生[10]的方法。光合参数采用英国PP-system公司的CIRAS—Ⅱ型便携式光合系统在上午9∶00～11∶00进行测定。测定时LED光源设为1200Lux，净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)等参数均采用仪器自控系统控制；根据WUE=Pn/Tr计算水分利用效率。

1.3 叶片叶绿素荧光参数的测定

采用英国Hansatech公司生产的M-PEA多功能植物效率仪进行叶绿素荧光参数及快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)的测定，测定前叶片充分暗适应25 min,重复10次。所得荧光参数如下：暗适应后的初始(最小)荧光强度(Fo)；最大荧光强度(Fm)；最大光化学效率Fv/Fm；PSⅡ的潜在活性Fv/Fo；照光2 ms时的荧光强度(FJ)；照光30 ms时的荧光强度(FI)；照光t时间的可变荧光强度Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)；K点的相对可变荧光WK；J相相对可变荧光VJ；单位面积吸收的光能ABS/CSm=Fm；单位面积捕获的光能TRo/CSm；单位面积电子传递的量子产额ETo/CSm；单位面积内反应中心的数量RC/CSm；以吸收光能为基础的性能指数PIabs；综合性能指数PItotal等。

利用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片叶绿素含量的影响

从图1A和图1C可以看出，在正常供水(CK)条件下，3种矮化中间砧组合叶片中叶绿素a和叶绿素a+b含量显著高于YG/Mb组合，轻度干旱胁迫(LD)时，各砧穗组合间差异不显著，进入中度(MD)和重度(HD)干旱胁迫时，YG/77-34/Mb和YG/Mb组合显著高于YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb组合，且在MD时，YG/Mb组合叶片中叶绿素a+b含量显著高于YG/77-34/Mb组合；另外，在MD时，各组合叶片中叶绿素a和叶绿素a+b含量比CK和LD显著降低，进入HD时，比MD显著降低。各砧穗组合叶片中叶绿素b含量在不同干旱胁迫条件中差异不显著(图1B)；进入MD时，显著低于CK和LD，进入HD时，YG/Mb组合与MD差异不显著，其他3种矮化中间砧组合显著低于MD。

注：图中小写字母表示同处理不同砧穗组合间差异显著，大写字母表示同砧穗组合不同处理间差异显著(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters mean significant difference among the same treatments and different stion; capital letters mean significant difference among the same stion and different treatments (P<0.05), the same below.图1 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片叶绿素的影响Fig.1 Effects of different stion on Chlorophyll of leaves under water stress

2.2 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片光合特性的影响

由图2A可以看出，不同砧穗组合“岳冠”叶片净光合速率(Pn)对干旱胁迫的响应程度不同，在LD时，各砧穗组合叶片的Pn与对照相近，但MD和HD时，显著低于CK和LD；在LD时，各组合差异不显著，进入MD和HD时，YG/Mb组合最高，其次是YG/77-34/Mb组合，在MD时显著高于YG/L2/Mb组合，在HD时显著高于其他两个矮化中间砧组合。各砧穗组合的气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)在不同干旱胁迫条件下变化趋势与Pn相同(图2B、图2C)，呈逐渐降低的趋势，MD与HD间差异不显著，其他干旱胁迫间均差异显著；在MD时，YG/Mb组合的Gs和Tr显著高于其他3种矮化中间砧组合，而上述3种矮化砧组合间无显著差异；在HD时，YG/Mb和YG/L2/Mb组合的Gs和Tr显著低于另两种组合。各砧穗组合的胞间CO2浓度(Ci)变化趋势与前三者相反(图2D)，在HD时，YG/Mb比其他组合显著降低。各砧穗组合的水分利用效率(WUE)在不同干旱胁迫下差异较大(图2E)，由高到低依次为：LD>CK>MD>HD；YG/Mb组合只有在HD时高于其他3种矮化中间砧组合，在CK、LD和MD时均低于该3种矮化中间砧组合。

2.3 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片叶绿素荧光参数的影响

2.3.1 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的影响 从表1可以看出，随着干旱胁迫加剧，4种砧穗组合叶片的PSⅡ反应中心受到不同程度的破坏或失活，导致Fo增加；各砧穗组合在轻度干旱胁迫与对照间差异不显著， YG/GM256/Mb组合Fo值显著低于其他3种组合；进入中度和重度干旱胁迫后，YG/GM256/Mb和YG/L2/Mb组合的Fo值比对照分别上升19.7%、10.3%和43.1%、25.8%，YG/77-34Mb和YG/Mb组合上升幅度较小，分别为8.0%、5.3%和10.6%、15.0%。各砧穗组合在对照和轻度干旱胁迫时，Fv/Fm和Fv/Fo值均在0.82和4.9以上，且无显著差异；进入中度和重度干旱胁迫后，各组合的Fv/Fm和Fv/Fo值迅速下降，且与对照和轻度干旱胁迫差异显著；进入重度干旱胁迫后，YG/L2/Mb组合的Fv/Fm值最低(0.42)，显著低于其他3种组合，比对照下降幅度最大(49.3%)，其他3种组合间差异不显著，比对照下降8.8%～17.2%；Fv/Fo值也是YG/L2/Mb组合最低，其次是YG/GM256/Mb和YG/77-34Mb组合，YG/Mb组合最高，4种组合分别比对照下降了85.3%、54.9%、45.5%和38.0%，且差异显著；4种砧穗组合PSⅡ潜在活性下降情况依次为YG/L2/Mb>YG/GM256/Mb>YG/77-34Mb>YG/Mb。

2.3.2 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片快速荧光诱导动力学曲线的影响 如图3所示，经过不同干旱胁迫处理后，4种砧穗组合叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线发生明显的变化。在CK和LD时，各砧穗组合在300μs的荧光强度(Fk)(11 000左右)和2 ms的荧光强度(Fj)(25 000左右)无显著差异，进入MD和HD后，Fk和Fj值显著升高，分别达到了16 000和30 000左右，说明中度和重度干旱胁迫增加了4种砧穗组合的Fk和Fj值。另外，在CK时，各砧穗组合O-J相变化无明显差异；经过LD后，YG/L2/Mb组合的J-I相拐点开始逐渐消失，且I点和P点的荧光产额显著低于其他3种砧穗组合，而其他3种组合间P点荧光产额以YG/Mb组合最高；进入MD后，曲线J-I相的表现为：YG/Mb组合具有较明显拐点，YG/77-34/Mb组合的拐点逐渐消失，而YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb组合的拐点已经消失，P点荧光产额YG/Mb组合高于YG/77-34/Mb组合；当达到HD时，3种矮化中间砧组合的曲线J-I-P相趋于平缓，拐点消失，只有YG/Mb组合的曲线J-I-P相存在模糊拐点；以上结果表明在3种干旱胁迫条件下，YG/Mb组合光合机构的破坏程度最低，其次是YG/77-34/Mb组合，YG/L2/Mb组合破坏程度最重。

表1 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的影响

注: 表中小写字母表示同处理不同砧穗组合的差异显著，大写字母表示同砧穗组合不同处理的差异显著(P<0.05)，下同。

Notes: Different lowercase letters mean significant difference among the same treatments and different stion; capital letters mean significant difference among the same stion and different treatments (P<0.05), the same below.

2.3.3 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片WK、VJ、PIabs和PItotal的影响 从表2可以看出，随着干旱胁迫加剧，4种砧穗组合叶片的WK和VJ值升高；正常供水时，各砧穗组合的VJ值无显著差异；经过轻度干旱胁迫后，YG/L2/Mb组合的WK和VJ值显著高于其他3种组合，并比对照上升36.7%和22.9%，VJ值显著高于CK；达到中度干旱胁迫时，YG/L2/Mb组合的WK和VJ值上升幅度最大，分别比对照上升了125.6%和62.9%，其次是YG/GM256/Mb组合，比对照上升了78.3%和58.8%，YG/Mb组合上升幅度最小，为21.1%和27.8%；进入重度干旱胁迫后，各砧穗组合的WK和VJ值比对照上升幅度均超过了93.0%和69.4%，但仍然是YG/L2/Mb组合最高，YG/Mb和YG/77-34/Mb组合最小。各砧穗组合的PIabs和PItotal值在轻度干旱胁迫与对照间差异不显著；经过中度干旱胁迫后，YG/L2/Mb组合下降幅度最大，分别比对照下降70.8%和76.6%，其次是YG/GM256/Mb组合，分别比对照下降67.7%和73.7%，YG/Mb和YG/77-34/Mb组合最小，分别比对照下降了56.7%、61.7%和58.0%、67.1%；进入重度干旱胁迫后，4种砧穗组合均比对照下降了80%以上，且各砧穗组合间的PIabs值存在显著差异，大小依次为YG/Mb>YG/77-34Mb>YG/GM256/Mb>YG/L2/Mb组合，YG/Mb和YG/77-34Mb组合间的PItotal值无显著差异，但与其他两种组合差异显著。

图3 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片快速荧光诱导动力学曲线的影响Fig.3 Effects of different stion on the fast chlorophyll fluorescence induction dynamics of leaves under water stress

处理 Treatment砧穗组合 StionWKVJPIabsPItotal对照ControlYG/L2/Mb0.11±0.006bC0.35±0.02aD7.26±0.61aA6.92±0.14aAYG/GM256/Mb0.11±0.008bC0.34±0.01aC7.45±0.40aA6.89±0.24aAYG/77-34/Mb0.14±0.007aC0.34±0.01aC6.95±0.19aA6.70±0.16aAYG/Mb0.13±0.009aC0.36±0.01aC6.86±0.35aA6.88±0.21aA轻度干旱胁迫Slight water stressYG/L2/Mb0.15±0.003aC0.43±0.02aC6.39±0.44aA6.51±0.21aAYG/GM256/Mb0.11±0.009bC0.36±0.01bC6.98±0.51aA6.46±0.30aAYG/77-34/Mb0.13±0.009bC0.35±0.01bC6.64±0.29aA6.52±0.09aAYG/Mb0.13±0.010bC0.36±0.01bC7.20±0.60aA6.96±0.08aA中度干旱胁迫Medium water stressYG/L2/Mb0.25±0.010aB0.57±0.02aB2.12±0.14cB1.62±0.02cBYG/GM256/Mb0.19±0.005bB0.54±0.03abB2.41±0.14bB1.81±0.05cBYG/77-34/Mb0.18±0.009bcB0.49±0.01bB2.92±0.18abB2.21±0.06bBYG/Mb0.16±0.006cB0.46±0.02bB2.97±0.11aB2.63±0.12aB重度干旱胁迫Severe water stressYG/L2/Mb0.33±0.015aA0.68±0.04aA0.20±0.00dC0.11±0.00cCYG/GM256/Mb0.31±0.006abA0.62±0.04bA0.65±0.02cC0.31±0.01bCYG/77-34/Mb0.29±0.016bcA0.62±0.04bA0.72±0.01bC0.95±0.04aCYG/Mb0.26±0.004cA0.61±0.03bA1.24±0.02aC0.90±0.01aC

2.3.4 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片单位横截面积能量流参数和反应中心密度的影响 从表3可以看出，在正常供水条件下，YG/GM256/Mb组合叶片单位面积吸收的光能(ABS/CSm)、捕获的光能(TRo/CSm)、用于电子传递的能量(ETo/CSm)和反应中心的数量(RC/CSm)显著低于其他3种砧穗组合；轻度干旱胁迫增加了4种砧穗组合叶片3种能量流参数和反应中心密度，其中YG/GM256/Mb组合的3种能量流参数和反应中心密度仍显著低于其他3种砧穗组合，YG/L2/Mb组合的ABS/CSm、TRo/CSm和RC/CSm比对照显著提高；而中度和重度干旱胁迫降低了各砧穗组合的3种能量流参数和反应中心密度，各砧穗组合3种能量流参数和反应中心密度受损程度依次为：YG/L2/Mb>YG/77-34Mb>YG/GM256/Mb>YG/Mb组合。

表3 干旱胁迫下不同砧穗组合对叶片单位横截面积能量流参数和反应中心密度的影响

3 讨 论

3.1 干旱胁迫影响不同中间砧苹果叶片的光合特性

叶片中光合色素含量直接影响植物光合能力，其中以叶绿素a最为重要。有研究表明，植物遭受干旱胁迫时，叶片中叶绿素含量大幅降低[11]，本研究中(图1)，轻度干旱胁迫时，3种矮化中间砧组合与对照无显著差异，中度和重度干旱胁迫后，各砧穗组合叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量迅速下降，可能干旱直接导致叶绿素降解或造成植株吸收营养元素困难引起缺素症状，使叶绿素含量降低，其中YG/Mb和YG/77-34/Mb组合在中度和重度干旱胁迫的受损程度轻于YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb组合。

研究表明，一般在干旱后期非气孔限制因素是限制Pn的主要因素[12-13]，主要表现在羧化效率下降，Rubisco活性降低或是再生能力减弱；干旱胁迫使碳同化速率降低，Pn下降，从而导致光能过剩和产生光合作用光抑制[14]；何亚南[15]对1a生矮化自根砧和中间砧‘富士’研究认为，在中度和重度干旱胁迫下，‘M26’ 作中间砧Pn值高于‘M26’作自根砧；本试验研究结果表明(图2)：在中度和重度干旱胁迫时，各砧穗组合的Gs显著低于对照，从而影响植物对CO2的同化和对水分的利用，使叶片Pn和WUE下降，光合碳同化作用受阻，但Ci浓度升高，所以此时影响光合的因子主要是非气孔限制，并且Pn值随着矮化性的增加而降低，这与前人的研究结果一致；同时在中度干旱胁迫且Ci浓度相同条件下，YG/Mb和YG/77-34/Mb组合的Gs和Tr高于其他组合，使Pn值较高，说明YG/Mb和YG/77-34/Mb组合受气孔限制因素更小一些。

3.2 干旱胁迫影响不同中间砧苹果叶片的PSⅡ反应中心活性及电子传递

叶绿素荧光技术是光合作用的探针，通过荧光参数可以分析光合机构内部一系列重要的调节过程。PSⅡ位于类囊体膜上，是光合机构对环境胁迫的敏感部位，是光抑制的原初位点[16]。初始荧光Fo是判断PSⅡ反应中心运转情况的重要指标，其增加表明PSⅡ反应中心受到破坏或失活[17]；最大光化学效率Fv/Fm是反映PSⅡ活性中心光能转换效率的重要参数[18-21]，Schansker和Rensen发现[22]，大于0.44时，PSⅡ活性随Fv/Fm的降低而下降，用于光合电子传递的能量减少，小于0.44时完全失去活性；Fv/Fo反映PSⅡ的潜在活性，与Fv/Fm是光化学反应状况评价的重要参数[23]。本试验研究结果表明(表1)：各砧穗组合在轻度干旱胁迫与对照无显著差异，进入中度和重度干旱胁迫后，Fo、Fv/Fm和Fv/Fo分别迅速上升和下降，说明各砧穗组合叶片类囊体膜结构发生变化，PSⅡ反应中心受到破坏，光合作用原初反应过程受抑制，电子由PSⅡ反应中心向QA、QB及PQ库传递均受到抑制，可能引起 D1蛋白降解[24]，其中YG/Mb和YG/77-34/Mb组合受到破坏程度低于另两种组合，另外YG/L2/Mb组合的Fv/Fm值在重度干旱胁迫时为0.42，说明PSⅡ活性中心遭受不可逆失活。

光合性能指数PIabs是以吸收光能为基础的性能指数，主要反映PSⅡ反应中心效率，有研究认为，PIabs对某些胁迫所反映植物光合机构的状态比Fv/Fm更敏感，可以综合评价葡萄的抗旱性[6,28-29]；但不能反映光系统Ⅰ(PS-Ⅰ)反应中心转化情况；综合性能指数PItotal能进一步反映电子在 PSⅡ和PSⅠ之间传递能力及 PSⅠ的相关性能[30]；ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和RC/CSm分别表示叶片单位面积吸收的光能、单位面积捕获的光能、单位面积电子传递的量子产额和单位面积内反应中心的数量。本研究中，各砧穗组合的PIabs、Fv/Fm和PItotal的变化对干旱胁迫都比较敏感，在中度和重度干旱胁迫时，下降幅度均较大，说明中度和重度干旱胁迫不仅使PSⅡ反应中心受到伤害，同时也使PSⅠ的功能遭到破坏；另外也降低了3种能量流参数和反应中心密度(表3)，其中受损程度依次为YG/L2/Mb>YG/GM256/Mb>YG/77-34/Mb>YG/Mb组合。

4 结 论

在轻度干旱胁迫时，4种砧穗组合无显著差异；随着水分胁迫程度增加，各组合叶片的气体交换参数受到影响，PSII和PSI活性下降，导致光合特性受到抑制，3种矮化中间砧组合在中度干旱胁迫时，77-34组合受破坏较轻，抗旱性最好，辽砧2号组合破坏最重，GM256组合介于二者之间；在重度干旱胁迫时，77-34组合抗旱性最好。因此在辽宁气候较干旱地区，如果采用矮砧密植栽培方式，利用幼树建苹果园可以优先考虑YG/77-34/Mb组合。