陇南小麦条锈菌夏孢子的周年动态变化规律

郭丽丽，户雪敏，张升恒，李 颖，伏松平，范三红，胡小平

(1.西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌 712100；2.农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室, 陕西杨凌 712100；3.天水市植物保护检疫站，甘肃天水 741020；4.西北农林科技大学生命学院，陕西杨凌 712100)

小麦条锈病是由条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的重要世界流行性病害，主要由气传性病原菌夏孢子随气流进行传播[1]，其发生范围广，为害严重，大流行年份可造成小麦绝收[2]。对于气传性病害，监测空气中的病原菌孢子动态对病害的及时防控至关重要。胡同乐等[3]通过对生长季苹果园空气中苹果斑点落叶病菌分生孢子捕捉发现，6-7月份为整个生长季中孢子飞散的高峰期。傅俊范等[4]对稻曲病病菌分生孢子监测始见于7月下旬，飞散期为7-9月。利用孢子捕捉仪捕捉空气中病原菌孢子的方法也在黄瓜霜霉病、番茄灰霉病及小麦白粉病等禾本科作物及蔬果病害研究中得到广泛应用[5-7]。对小麦条锈病的流行预测，谷医林等[8]只在2013-2015年3-6月运用孢子捕捉仪对甘谷县小麦条锈菌进行监测，发现空气中夏孢子的峰值出现在5-6月，但未对整个周年的夏孢子变化情况进行研究。同时，任何病原菌的发生程度及流行范围都需要适宜的环境条件。宋晶晶等[9]发现，空气中小麦白粉菌的孢子量与温度、相对湿度呈负相关，与降雨量呈正相关。谷医林等[8]发现，小麦条锈菌夏孢子密度与温度呈正相关，而与相对湿度呈负相关。

陇南小麦条锈病流行区，包括天水地区渭河流域、嘉陵江上游徽成盆地与四川接壤的白龙江流域，是中国小麦条锈菌的主要越夏地之一，能够向我国东部麦区传播菌源，具有至关重要的战略地位[1]。因此，本研究通过监测陇南小麦条锈菌夏孢子周年动态，并结合田间温度、相对湿度及降雨分析影响该地区2018年3月-2019年3月的夏孢子循环规律的关键因子，以期为当地小麦生产制定有效的防治策略，减少陇南夏孢子向东部大部分麦区的传播。

1 材料与方法

1.1 田间样本采集

2018年3月-2019年3月，在甘肃省天水市秦州区监测点(34.2° N，105.4° E，海拔1 710 m)放置Burkard孢子捕捉仪(英国Burkard Manufacturing有限公司)，通过进气口抽取空气样本，自动将样本储存至1.5 mL离心管中(进气量为16.5 L·min-1)，每周更换一次离心管。样本于-80 ℃中保存，待提取DNA。

1.2 条锈菌夏孢子测定

1.2.1 模拟样本及DNA的提取

1.2.2 TaqMan RT-qPCR供试引物及体系优化

根据小麦条锈菌延伸因子EF1的扩增长度来设计引物和特异性探针(表1)。以小麦条锈菌和常见病原菌叶锈菌、秆锈菌、赤霉菌和白粉菌的DNA为模板，按下述条件进行TaqMan RT-qPCR(TaqMan Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction)，验证引物的特异性。TaqMan RT-qPCR体系为：Taqman Environment Master Mix 2.0 (美国Life techonologies有限责任公司) 10 μL，探针和引物(上海英俊生物技术有限公司)各0.5 μL(250 nM)，DNA模板5.9 μL，补ddH2O至20 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。在Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏诊断有限公司)上进行。

1.2.3 TaqMan RT-qPCR重复性评价及标准曲线的建立

分别取上述5×105～5×100个· μL-1梯度模拟样本的DNA模板，同时以Nuclease free water为阴性对照，按上述反应体系和程序进行TaqMan RT-qPCR。每个稀释度重复3次，计算变异系数，评价重复性。根据5×105～5×100个· μL-16个梯度的夏孢子浓度对数(x)和对应的Ct(cycle threshold)值(y)绘制标准曲线。

表1 TaqMan RT-qPCR设计的特异性引物和探针Table 1 Specific primers and probes designed by TaqMan RT-qPCR

1.3 气象数据获取及相关性分析

计算全自动小型气象监测仪(西安黄氏生物工程有限公司)记录的相应采样时间段的日平均温度、日平均相对湿度和累积降雨量。采用Pearson相关分析法分析气象因素与田间捕捉的夏孢子浓度相关性。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2016绘制TaqMan RT-qPCR标准曲线；采用SAS计算标准差和变异系数；运用SPSS软件的Pearson分析法进行相关性分析；使用Light Cycler 480实时荧光定量PCR检测系统自带软件生成扩增曲线。

2 结果与分析

2.1 TaqMan RT-qPCR引物及体系评价

提取小麦叶锈菌、秆锈菌、赤霉菌、白粉菌及条锈菌的DNA，用TaqMan RT-qPCR方法检测引物特异性，结果显示，所有反应中仅有小麦条锈菌在14～35个循环时检测到荧光扩增曲线，而叶锈菌、秆锈菌、赤霉菌、白粉菌及水对照在循环数40时都未检测到荧光扩增曲线。结果表明，所建立的条锈菌TaqMan RT-qPCR检测方法具有特异性(图1)。

将浓度为5×105～5×100个· μL-1的夏孢子模拟样品在同一条件下进行TaqMan RT-qPCR，每个浓度重复3次，Ct值的平均值分别为20.40、23.30、26.81、29.21、31.44和34.84；变异系数依次为0.52%、0.33%、0.11%、0.37%、 0.50%和0.28%，均小于1%(表 2)，说明该检测方法具有良好的重复性。

2.2 标准曲线

运用TaqMan RT-qPCR方法对浓度为5×105～5×100个· μL-16个梯度夏孢子模拟样品进行定量，以不同梯度的夏孢子浓度对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标绘制标准曲线(图 2)。标准曲线方程为y=-2.830 6x+37.572，决定系数(R2)为0.995 8。Ct平均值范围为20.40～34.84，最低可检测到5个夏孢子。

2.3 田间捕捉的夏孢子浓度变化动态

从陇南空气中小麦条锈菌夏孢子的周年动态监测中发现，随着时间的推移，夏孢子在4月11日、5月16日和6月6日出现了3个数量高峰，其中4月11日孢子密度达到最大值，为145 个·m-3(图3)。但在小麦收割(7月初)后至10月底，空气中只能检测到零星的夏孢子。11月初到翌年2月末，没有捕捉到夏孢子。翌年3月，随着气温的回升，在3月6日初次检测到少量夏孢子，之后夏孢子数量呈明显增加趋势，3月13日达45个·m-3。

图1 小麦条锈菌特异性引物TaqMan RT-qPCR扩增曲线

表2 夏孢子浓度梯度的TaqMan RT-qPCR结果及重复性分析Table 2 Repeatability analysis of TaqMan RT-qPCR at different urediniospores concentration

图2 小麦条锈病夏孢子数量与Ct值之间的关系

2.4 气象因素对空气中夏孢子密度的影响

相关性分析表明，陇南空气中冬小麦锈菌夏孢子密度与空气相对湿度呈极显著负相关 (r=-0.449，P=0.009)，且夏孢子的密度高峰值集中在空气相对湿度50%～80%范围内(图4)，而夏孢子密度与平均温度和累积降雨量无显著相关性(r分别为-0.003和0.107，P值分别为0.494和0.298)，说明相对湿度对条锈菌夏孢子的扩散影响较大。降雨减少会降低空气中的夏孢子数量，如4月11日前的累积降雨量为23.0 mm，5月16日的累积降雨量为12.6 mm，夏孢子密度从145个·m-3减少到13个·m-3；降雨量过大时，空气中的夏孢子数量会随雨水冲刷而减少，如6月下旬到7月上旬，出现2次暴雨，捕捉到的夏孢子数明显减少。12月至翌年2月，没有捕捉到夏孢子(图4)。

图3 2018年陇南小麦条锈菌夏孢子动态变化规律

图4 气象因子对条锈菌夏孢子浓度的影响

3 讨 论

陇南地区是我国条锈病的“常发易变区”，明确陇南地区条锈菌夏孢子的周年流行动态，对病害的防控有一定的指导作用。科学有效的预测田间小麦条锈病的流行动态，需要以准确的初始菌源量为前提。已有利用孢子捕捉仪与实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法监测病原菌数量动态变化来预测田间病害发生情况的报道，如桃褐腐病、大豆锈病、甜菜霜霉病、菠菜霜霉病、小麦赤霉病等[10-14]。李勇等[15]开发了TaqMan RT-qPCR检测小麦条锈病菌的方法，检测灵敏度达10个夏孢子。本研究应用TaqMan RT-qPCR方法建立了小麦条锈菌夏孢子数量与Ct值之间的关系，检测灵敏度为5个夏孢子。

陇南地区有复杂的自然环境和生态条件，且小麦在800～2 400 m高度范围呈垂直分布，条锈菌在该区既能越夏、又能越冬，可就地完成周年循环，有利于菌源积累[16]。本研究对陇南小麦条锈菌夏孢子进行周年监测，发现11月至翌年2月未检测到条锈菌夏孢子，推测是因为该地区周围的冬小麦种植时间为9月26日，较往年播期晚10天；天水市植保站工作人员在11月13日调查15块田地(约20亩)秋苗发病情况时，仅有2块麦田各有1片病叶，发病程度为近几年最轻；2018年12月至翌年2月雨雪少，积雪覆盖时间短。贾明贵等[17]研究结果表明，1989年在天水地区降雪迟，雨雪少(16.5 mm)，在高山区(海拔为1 700 m以上)未发现有条锈菌越冬。2019年3月6日初次捕捉到夏孢子，3月13日夏孢子数量明显增加，推测夏孢子可能来源于1 300 m～1 600 m半山区越冬菌源基地向高山区扩展的夏孢子[16]，或随东风或东南风自冬麦区传向此地[18]。

病害的发生和流行不仅需要合适的寄主和病原，环境因素也发挥着关键性作用[19]。前人研究证明，春季降雨是影响小麦条锈病发生和流行的重要因素，对条锈菌夏孢子的扩散有潜在的促进作用，夏季降雨是限制越夏菌源的重要因素[2]。本研究发现，降雨与孢子密度呈正相关。谷医林[8]证明空气中孢子密度与相对湿度呈负相关，且在湿度处于60%左右的水平时，孢子密度出现最大值。本研究中，2018年天水市秦州区监测点的夏孢子密度高峰值集中在空气相对湿度的50%～80%范围内，且与相对湿度呈极显著负 相关。

综上所述，本研究基于孢子捕捉仪和TaqMan-qPCR定量方法，明确了陇南条锈菌夏孢子的周年变化规律，同时分析了温度、相对湿度和降雨对陇南小麦条锈菌夏孢子动态的影响，为后期构建基于条锈菌夏孢子数量和气象因子的预测模型奠定基础，同时也为我国小麦条锈病的早期防治提供理论依据和参考价值。