茶条槭茎段组织培养与植株再生研究

杨兰芳　张国禹　黄桂云　吴笛　张定军　李翩翩

摘要    春季剪取茶条槭当年生枝条的带顶芽茎尖和带腋芽茎段以0.1%HgCl2分别消毒4、10 min最好;茶条槭当年生带芽茎段增殖培养基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上培养，增殖效果最好，生长良好，且兼顾了增殖与生根，缩短了培养周期。经生根的试管苗移栽于珍珠岩∶园土=1∶3基质中，植株生长健壮，成活率达90%。

关键词    茶条槭;带芽茎段;组织培养

中图分类号    S792.99        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）19-0128-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

茶条槭（Acer ginnala）为槭树科槭属落叶树种，树形优美，叶形清秀，秋叶红艳，是一种极具开发价值的园林树种。此外，其木材可做细木;嫩叶经加工可代茶用，还可提取大量的没食子酸，广泛应用于医药、化工、食品、轻工、印染、军工等方面，尤其在医药上对治疗肝病有特效。由于茶条槭野生数量较少，加之掠夺性采收，目前已处于濒危状态。本试验以带腋芽茎段为外植体研究不同消毒时间、取材部位对无菌再生体系建立的影响，为解决茶条槭优良栽培种快繁、品种改良及遗传转化工作做好前瞻性的基础研究，同时为进一步利用基因工程手段改良提供基础材料。

1    材料與方法

1.1    试验材料

以长江珍稀植物研究所种质资源圃内株高3 m左右、胸径6 cm左右的茶条槭为研究对象，于4—5月剪取其主干基部或下部当年生萌条作为试验材料。

培养基均附加3%蔗糖、5 g/L琼脂以及不同浓度的植物生长调节剂。使用前，用1 mol/L NaOH将pH值调至5.8～6.0，并在122 ℃高温、高压条件下灭菌30 min[1]。培养温度、光照强度、光照时间分别为（24±2）℃、800～1 000 lx、13 h/d。

1.2    试验方法

1.2.1    外植体消毒时间的筛选。本试验于4月开展，为研究外植体不同部位及消毒时间对茶条槭污染率的影响，主要分为2个部分：以茶条槭茎尖为外植体，0.1%HgCl2消毒时间分别为3、4、5 min;以茶条槭带腋芽茎段为外植体，0.1%HgCl2消毒时间分别为8、10、12 min。进行单因素试验，通过设计梯度试验，观察并比较外植体不同部位、不同消毒时间的污染情况，包括污染率、死亡率及其萌芽率等情况。

试验方案：首先用软毛刷蘸取洗液仔细刷洗叶腋及表皮，用自来水冲洗1～2 h。在无菌条件下，将材料放入75%酒精溶液中浸30 s，无菌水冲洗1～2次，再用0.1%HgCl2溶液消毒，消毒后用无菌水冲洗3～5次。最后放于无菌滤纸上吸干水分，将消毒后的外植体接种到启动培养基上[2-3]。每瓶培养基3个外植体，每处理设10个重复。试验2周后统计污染率，4周后统计死亡率、萌发率。

1.2.2    试管苗增殖生根培养。腋芽萌发后，待其长至1～2 cm时，切下转入含有不同浓度的培养基继代培养，继代采用MS为基本培养基，以NAA、6-BA和TDZ为3因素进行正交试验L8（4×24）。每种处理接种10瓶，每瓶接种2个，重复3次。接种后，每周观察1次小芽的伸长、增殖等情况;40 d后，统计不同生长调节剂处理的试管苗增殖系数（每外植体形成1.0 cm 以上次生小芽的个数）、生根情况等数据。

1.2.3    试管苗移栽。将生根培养40 d的试管苗移到实验室内有散射光的自然条件下炼苗。1周后，取出生根小植株，洗净根部琼脂并剪去基部叶片，移栽于装有珍珠岩、营养土（二者按1∶3混合）的营养钵中。每盆1株，共移栽30株，每3～4 d浇透水1次。60 d后，统计成活率并记录其生长情况[4-6]。

2    结果与分析

2.1    不同消毒时间对不同部位外植体污染的影响

从表1可知，茶条槭茎尖用0.1%HgCl2消毒4 min时，污染率较低（16.7%），成活率最高（70.0%），其萌芽率也相对较高（86.7%）;消毒时间为3 min时，成活率大幅下降（46.7%），污染率最高（43.3%）;消毒时间为5 min时，成活率最低（20.0%），污染率最低（10.0%）。可见，用0.1%HgCl2对茎尖消毒时，消毒时间为4～5 min对茶条槭茎尖污染率的影响不大，但褐变死亡率随消毒时间的延长大幅提升。在对茶条槭带芽茎段消毒时，使用0.1%HgCl2消毒10 min成活率最高，可达到60.0%，污染率也相对较低，为25.0%，萌芽率也高;消毒8 min时，成活率最低，为23.4%，污染率最高（68.3%）;消毒12 min时，污染率最低。随着消毒时间延长，褐变死亡率上升，成活率低。因此，在用0.1%HgCl2对茶条槭外植体消毒时，幼嫩茎尖的消毒时间控制在4 min较好，带芽茎段的消毒时间最好控制在10 min左右，其成活率和萌芽率都相对最高。

2.2    试管苗增殖生根培养

将腋芽萌发而来的无菌试管苗接种到不同的增殖培养基中后，其基部先是略有膨大，呈黄绿色，随后在部分培养基上，幼苗基部形成一定大小的团块状愈伤组织，2周左右，开始从基部和腋芽处分化出新芽。

由表2可知，TDZ在1.0 mg/L的水平上较其他水平有极显著性差异，其芽的平均诱导个数为32.833个;TDZ含量为0.5 mg/L和2.0 mg/L时，其芽的平均诱导个数分别为24.500个和19.833个，二者差异不显著;含量为0.1 mg/L时，芽的平均诱导个数为2.167个。从6-BA的含量来看，0.1 mg/L芽诱导数极显著高于0.5 mg/L;从NAA的含量来看，0.2 mg/L芽诱导数极显著高于0.5 mg/L。由此得出，茶条槭诱导增殖的最好理论组合为NAA 0.2 mg/L、6-BA 0.1 mg/L、TDZ 1.0 mg/L。

由表3可知，5号配方对芽的增殖效果极显著的高于其他组合。从丛生芽的诱导率方面，1、2号配方的增殖效果最差，诱导率仅8.3%、13.3%;其次是8号配方，其诱导率76.7%;3、4、5、6、7号配方，诱导率都是100.0%。芽诱导数方面，5号配方芽诱导个数最多，为46个;其次是4号配方，芽诱导个数为29个;再次是7号配方，芽诱导个数为24个;然后是3、6号配方，芽诱导个数均为20个;最后是1、2号配方，芽诱导个数分别为2、3个。在丛生芽的平均长度方面，5、6号配方芽长均为3.8 cm;然后依次是7号配方>3号配方>8号配方>4号配方>2号配方>1号配方，其芽长分别为2.7、2.6、2.3、1.9、1.8、1.6 cm。不定根的产生方面，本试验发现，茶条槭增殖是先产生不定根，有利于芽的增殖。在配方組合中发现，除1、2号配方不能产生不定根外，其他均能产生不定根。

由上述可知，在培养基MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中，丛生芽的增殖效果相对较好，不仅增殖系数较高，幼芽生长也较快。但是在长期继代增殖过程中，激素的积累会导致试管苗生长状态有一些细微的改变，因而应根据实际情况灵活调整激素的浓度。

2.3    移栽

将生根培养40 d后，达移栽标准的试管苗移到培养室外，在自然光条件下炼苗3～7 d，在移栽前3～5 d打开瓶盖。移栽后浇透基质，放于2号PVC温室大棚养护管理（图1）。

从基质对移栽成活率的影响考虑，茶条槭是喜排水良好的砂质壤土的植物。因此，选择透气性较好、所含营养物质较多的园土与珍珠岩进行配比，以3∶1的比例混合拌匀作为移栽基质。茶条槭喜光，移栽后将其置于散射光丰富区域。移栽后1～3周，每天喷水1～2次，空气相对湿度保持在60%以上，但不要超过90%，温度保持在20 ℃左右。根据天气情况加遮荫网避免强光直射，降低棚温。移栽后2～3周，植株长出新叶后，适当除去温棚遮荫网，使其逐渐适应外界环境条件。移栽后苗高达到5 cm左右时，适当控制温棚温度及光强即可。移栽2个月后，统计成活率为90%，所有幼苗均生长良好。植株在营养钵中生长至高15～20 cm时，移至大田苗圃进行定植，目前仍生长良好，形态上未见任何变异。

3    结论与讨论

研究发现，一是以半木质化的幼嫩茎段作为外植体材料，具有萌发快、发生率高、褐化率低的特点;二是萌发早与萌发率高，通常接种1周左右可达到100%的萌发率;三是在茶条槭组织培养中，茎尖培养萌发率劣于茎段萌发率，且茎段中木质化程度越低，诱导率越高;四是材料的幼嫩程度决定其褐化程度，木质化严重的材料褐化也严重;五是光照对褐化有影响，在接种培养时，不改变其培养温度与湿度，适当降低其光照强度，对防止褐变有一定效果。

4    参考文献

[1] 董杰，齐凤慧，詹亚光.茶条槭悬浮培养体系的建立与没食子酸合成的优化条件[J].植物学通报，2008，25（6）：734-740.

[2] 李岩岩.茶条槭（Acer ginnala）组织培养与快速繁殖技术研究[D].兰州：甘肃农业大学，2007.

[3] 李海燕.茶条槭（Acer ginnala Maxim.）组织培养及愈伤组织中没食子酸代谢调控的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2007.

[4] 李海艳，宋继园，董杰，等.茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定[J].植物学通报，2008，25（2）：212-219.

[5] 孟月娥，周子发，李艳敏，等.茶条槭的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005，41（6）：790.

[6] 李岩岩.茶条槭组织培养与快速繁殖技术研究[J].山东林业科技，2010（2）：48-50.