岗梅清瘟败毒合剂的提取工艺优化及薄层色谱鉴别方法▲

金雪峰 刘 元 陈 英

(1 广西壮族自治区人民医院临床药学科，南宁市 530021，电子邮箱：jinxuefeng_521111@126.com；2 广西中医药研究院，南宁市 530022)

手足口病是由多种肠道病毒引起的传染性疾病，以婴幼儿发病为主。该病以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征，属自限性疾病，严重威胁人类尤其是儿童的健康[1-2]。引起手足口病的肠道病毒主要包括新型肠道病毒71型和A组柯萨奇病毒等[3-4]。对于该疾病的治疗，现代医学主要以抗病毒、预防感染为主，尚无特效药物和疫苗。因此，研发一种能够快速缓解病情、特异性有效治疗手足口病的新型药物制剂，是一个亟待解决的国际性难题。

壮医理论提出人体因毒发病，因气虚受有形无形之毒侵犯，应以调气、解毒、补虚为原则，采用药物解毒功效以达治疗目的[5]。岗梅清瘟败毒合剂是广西壮族自治区人民医院根据广西地方民族经验方，经筛选后研制的中药民族药制剂，主要由生石膏、麻黄、山芝麻、梅叶冬青、黄芩、贯众、杏仁、桔梗、柴胡等组成，具有清热宣肺、透疹生津之功效，用于证属风温邪在肺卫证及风温邪热壅盛证的手足口病，亦可用于感冒证属风热证者。本文通过正交实验法确定其最佳提取工艺，此外采用薄层色谱法定性鉴别了处方中的黄芩、粉葛、柴胡，旨在控制本品质量、确保其疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 YOKO-ZS紫外分析摄影仪、YOKO-BD薄层电动点样仪均购自武汉药科新技术开发公司，LC3000I型高效液相色谱仪、UV3000紫外检测器、CXTH-3000色谱工作站购自北京创新通恒科技有限公司。

1.2 试药 乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定研究院提供，供含量测定用，批号：110737-201516)。黄芩苷对照品(批号：111754-200601)、葛根素对照品(批号：110756-200110)、柴胡对照药材(批号：121465-200501)均购自中国药品生物制品检定所。岗梅清瘟败毒合剂由广西壮族自治区人民医院提供(批号：180729、180730、180731)。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 因素水平的确定：选取药材浸泡时间(A)、提取溶剂量(B)、提取次数(C)、提取时间(D)作为水提的主要影响因素。设定药材浸泡时间为0 h、0.5 h、1.0 h 3个水平，提取溶剂量为加水量的8/6/6倍、10/8/8倍、12/10/10倍3个水平，提取次数为1次、2次、3次3个水平，提取时间为1 h、1.5 h、2 h 3个水平。采用L9(34)正交试验表安排正交试验，因素水平见表1。

表1 水提工艺条件正交试验因素水平表

2.1.2 提取方法：根据工艺要求，称取1/2个处方量药材9份，每份药材含石膏30 g、麻黄7.5 g、黄芩7.5 g、山芝麻10 g、岗梅根10 g、贯众10 g、杏仁7.5 g、桔梗10 g、柴胡12.5 g、芦根10 g、粉葛20 g、薏苡仁20 g、苍术10 g、淡竹叶7.5 g、炙甘草6 g(均购自南宁生源中药饮片有限责任公司)；分别根据L9(34)正交表(见表2)内的9个试验列号及条件进行，将每次试验的提取液滤过，合并滤液，滤液浓缩至500 mL，静置24 h，滤过，加入用适量热水煮沸溶解的羟苯乙酯0.3 g，加水调整总量至500 mL，备用。

2.1.3 麻黄碱含量的测定：精密称取麻黄碱对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得对照品溶液。取合剂5 mL，置具塞锥形量瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定重量，超声处理1 h(200 W，40 kHz)，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足缺失重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL进样，按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则[6]，测定每个实验样品提取所得麻黄碱的含量，结果见表2～3。

表2 L9(34)正交试验方案及结果

表3 正交试验方差分析结果

2.1.4 测定结果及提取条件的确定：各因素R值大小为C>D>B>A，由此可知，因素C是影响提取工艺的重要因素，因素B、D是次要因素，因素A是更次要的因素。再结合各因素K值进行分析，确定提取的最佳工艺条件为A1B1C2D2：(1)浸泡时间(A)，三者K值相差不大，为节省时间，故定浸泡时间为0 h；(2)提取溶剂量(B)，8/6/6倍的K值最高，且节省溶剂，故定提取溶剂量为加水量的8/6/6倍；(3)提取次数(C)，尽管提取3次的K值最高，但与提取2次相差不大，为节省时间、溶剂，大生产可不予以考虑，故定提取次数为2次；(4)提取时间(D)，提取2 h的K值最高，但与1～5 h获得总量基本一致，故定提取时间为1.5 h。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1黄芩的鉴别：取2.1.2中制备的岗梅清瘟败毒合剂30 mL，用盐酸调节pH值至1～2，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液备用)，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部中有关薄层色谱法的步骤[6]进行试验，吸取供试品溶液3～5 μL，对照药材溶液3～5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(4 ∶1 ∶10)为展开剂展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图1。

图1 黄芩苷薄层色谱图

注：1为岗梅清瘟败毒合剂180729供试品；2为岗梅清瘟败毒合剂180730供试品；3为黄芩苷对照品；4为缺黄芩阴性对照；5为岗梅清瘟败毒合剂180731供试品。

2.2.2 柴胡的鉴别：取2.1.2中制备的岗梅清瘟败毒合剂30 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，弃去乙酸乙酯液；水液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次25 mL，弃去洗涤液；蒸干正丁醇液，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材0.5 g，加适量水煮沸1 h，滤过，滤液浓缩至15 mL，水液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次25 mL，其余步骤同供试品溶液的制备方法，即得对照药材溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部中有关薄层色谱法的步骤[6]进行试验,吸取上述两种溶液各3～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加热至斑点显色清晰,日光下检视。在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图2。

图2 柴胡薄层色谱图

注：1为岗梅清瘟败毒合剂180729供试品；2为岗梅清瘟败毒合剂180730供试品；3为柴胡对照药材；4为缺柴胡阴性对照；5为岗梅清瘟败毒合剂180731供试品。

2.2.3 粉葛的鉴别：取2.2.1 中用于鉴别黄芩的备用水溶液，用氨试液调至中性,用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次25 mL；合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部中有关薄层色谱法的步骤[6]进行试验,吸取上述两种溶液各3～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干。置氨蒸气中熏后，紫外灯365 nm下检视。在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，见图3。

图3 葛根薄层色谱图

注：1为岗梅清瘟败毒合剂180729供试品；2为岗梅清瘟败毒合剂180730供试品；3为葛根素对照品；4为缺粉葛阴性对照；5为岗梅清瘟败毒合剂180731供试品。

3 讨 论

手足口病作为危害人类健康的重要传染疾病，目前尚无特效治疗药物。中医药或可通过综合治疗效应，对手足口病的防治发挥积极作用。祖国中医认为手足口病是由于外感时邪疫毒，内伤湿热蕴结，卫表被遏，肺气失宣，心脾积热所致；主要病位在肺、脾、心三脏，严重可累及心包经和肝经，同时存在卫气营血转变[7]。中医医治本病以清热利湿透疹为主要治疗原则，辛凉解表、清热、除湿、解毒、理脾助运兼以清化，采用辨证施治、分期论治等方法，可取得比较良好的疗效[8-9]。岗梅清瘟败毒合剂所包含的麻黄、柴胡具有发汗解表、宣肺平喘等功效[10-11]，黄芩、梅叶冬青、山芝麻等能够清热泻火、解毒凉血[12-13]，葛根、竹叶等能够疏风散热、生津开郁[14]，与壮医理论治疗疾病的基本原则相一致。利用正交实验设计，我们筛选出了岗梅清瘟败毒合剂的最佳制备工艺，具体条件为药材浸泡0 h，提取溶剂量为加水量的8/6/6倍，提取次数为2次，提取时间为1.5 h。这既节省了实验时间及实验试剂，又具有较高的提取效率，工艺稳定，适合大工业生产。

对于中药复方制剂的鉴别，应根据其特点，寻找简便、快速并具有较强专属性的方法，才能起到有效控制质量的目的[15]。为了更好地控制岗梅清瘟败毒合剂药品的质量标准，本研究制定了黄芩、粉葛、柴胡的薄层色谱鉴别方法。对于柴胡的鉴别，在提取供试品时，我们发现先用乙酸乙酯振摇提取并弃去乙酸乙酯液，再用水饱和的正丁醇振摇提取，色谱带清晰；在选择展开剂试验中，经比较三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3 ∶0.5)、三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)的层析效果，我们发现以前者作为展开剂时，展开剂极性太大，斑点Rf值过高，以后者为展开剂时，斑点Rf值最佳，分离效果最佳，故最终选择三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作为展开剂。在鉴别粉葛时，我们发现用盐酸酸化样品后，用乙酸乙酯振摇提取后的水溶液，再用水饱和的正丁醇振摇提取，样品斑点无杂质干扰。鉴别柴胡时，我们采用三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作为展开剂，斑点Rf值合适。黄芩、粉葛、柴胡的薄层色谱鉴别结果显示阴性无干扰，提示合剂的薄层色谱鉴别方法可行，专属性强，重复性良好，这有利于更好地控制岗梅清瘟败毒合剂的制剂质量。