扩张型心肌病患者左心室心肌组织中转化生长因子β、结缔组织生长因子和胶原蛋白的表达水平及临床意义▲

易 欣 刘 畅 周 易 蒋学俊

(1 武汉大学人民医院心血管内科，2 武汉大学心血管病研究所，3 心血管病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：yixin321624@126.com)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是在排除冠状动脉疾病所致缺血性心肌病或其他疾病导致心脏负荷异常的情况下，出现的以左、右心室扩张和心脏舒张/收缩功能障碍为临床特征的一类心肌病[1]。DCM是年轻患者发生心力衰竭的主要原因之一，也是心脏移植最常见的手术指征[2]。研究表明，心肌纤维化在DCM中起到重要作用，胶原蛋白在心肌组织中的过度增生和沉积是心肌纤维化的典型病理改变，尤以Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ，ColⅢ)为主[3]。已有学者发现，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、TGF-β2、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化中的重要促纤维化因子[4-6]。本研究旨在探讨TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白在DCM心肌组织中的表达情况及其与纤维化程度的相关性，进一步深入研究以上因子评估DCM患者心肌纤维化程度的可行性。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集9例行心脏移植术的DCM患者的受体心脏组织作为DCM组。纳入患者均符合2006年美国心脏协会制定的DCM诊断标准，即左心室舒张末期内径>55 mm、左心室射血分数<45%或左心室缩短速率<25%[7]。排除其他可以引起心脏扩张的心血管疾病和全身性疾病如冠状动脉性心脏病、先天性心脏病、高血压、自身免疫性疾病。同时收集因心源性因素所致移植失败的供体心脏组织7例作为对照组。

1.2 DCM患者临床资料的收集 收集DCM患者的超声心动图结果，包括左心室内径、右心室内径、左室射血分数。

1.3 心肌组织相关指标的检测

1.3.1 标本处理：切取DCM患者受体心脏及移植失败供体心脏的左心室心肌组织，于冰上迅速去除心脏表面的结缔组织，于生理盐水冲洗，分为两份：一份切成小组织块，放入冻存管内，液氮中迅速冷冻后-80℃保存，用于检测TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白的mRNA表达；另一份修剪后置于4%多聚甲醛内固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤制成石蜡切片，用于观察心肌组织结构、评估心肌纤维化程度。

1.3.2 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色：石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、下行梯度酒精脱苯、水洗、苏木素染色、0.1%盐酸酒精分化、Scott液返蓝、伊红染色、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。最后在显微镜(日本Olympus公司，型号：BX53)下观察心肌组织的形态结构及排列特点。

1.3.3 苦味酸-天狼星红(picric-sirius red，PSR)染色：制备好的石蜡切片常规脱蜡、脱水后，依次经磷钼酸染色、0.1%苦味酸-天狼星红染色、0.01 mmol/L盐酸分化、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。最后光学显微镜(日本Olympus公司，型号：BX53)下观察心肌组织中红色胶原纤维的分布情况，拍照并计算胶原容积百分比(collagen volume fraction，CVF)，CVF=胶原面积/图像面积×100%。

1.3.4 TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白mRNA表达水平的检测：采用实时荧光定量PCR技术检测心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表达水平。采用TRIzolTMReagent试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：15596026)提取总RNA。采用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司，批号：RR036A)，将RNA反转录为cDNA。再应用LightCycler® 480 SYBR Green Ⅰ Master试剂盒(德国Roche公司，批号：04707516001)进行PCR扩增反应，反应体系严格参照说明书配制，20 μL的反应体系包括10.0 μL LightCycler® 480 SYBR Green Ⅰ Master(2×)、0.5 μL 10 μmol/L PCR上游引物、0.5 μL 10 μmol/L PCR下游引物、1.0 μL cDNA模板和8.0 μL RNase Free dH2O；反应条件为预变性94℃ 2 min、变性95℃ 10 s、退火58℃ 30 s、 延伸72℃ 30 s，一共40个循环，72℃ 10 min延伸后，于4℃终止反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白mRNA的相对表达水平。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 DCM患者的超声心动图结果 超声心动图检查结果显示DCM患者双心室扩大，右心室内径为(51.25±6.99)mm，左心室内径为(71.33±13.59)mm，左心室扩张更为显著；心肌室壁运动幅度普遍降低，左室射血分数明显下降，为(26.22±9.18)%。

2.2 两组组织病理检查结果 与对照组相比，HE染色可见DCM组心肌组织排列紊乱、心肌细胞不同程度肥大，胞浆内少许空泡形成，核多形性增加，PSR染色可见DCM组心肌间质中大量红色胶原纤维沉积、弥漫性分布，见图1。此外，DCM组的CVF为(43.35±4.32)%，高于对照组的(1.65±0.43)%(t=-25.228，P<0.001)。

图1 对照组和DCM组心室肌组织的病理学改变(HE染色，×40；PSR染色，×20)

注：PSR染色中黄色为心肌组织，红色为胶原纤维。

2.3 两组心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白的mRNA相对表达水平比较 实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，DCM组心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、ColⅠ、ColⅢ的mRNA相对表达水平均升高(P<0.05)，见表2。

表2 两组心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白的mRNA相对表达水平比较(x±s)

2.4 DCM患者心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白的mRNA表达水平与CVF的相关性 相关性分析结果显示，DCM患者心室肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF、Col Ⅰ、ColⅢ的mRNA表达水平与CVF均呈正相关(r=0.924，P=0.003；r=0.955，P=0.001；r=0.964,P<0.001；r=0.941，P=0.002；r=0.858，P=0.013)。

3 讨 论

DCM是由遗传、感染、中毒、自身免疫等因素引起的，以心室扩张、室壁变薄、收缩功能降低为临床特点的一类心肌病，容易并发心力衰竭、恶性心律失常、心源性猝死等[1，8]。心室重构是DCM发生发展中最为重要的病理生理过程，而心肌纤维化是DCM心室重构的典型病理特征。心肌纤维化的进展与DCM的疾病进展密切相关，心肌纤维化的程度与DCM患者的预后密切相关[9-12]。因此，研究DCM心肌纤维化的临床特征和发生机制，寻找抗心肌纤维化的靶点，对控制DCM患者病情进展、改善临床预后具有重要的临床意义。

细胞外基质异常增生堆积，以及心脏成纤维细胞异常增殖、表型转化和迁移是心肌纤维化最主要的病理改变[13]。细胞外基质主要由丰富的ColⅠ、ColⅢ及较少的ColⅣ、ColⅤ、ColⅥ构成，他们在维持心室形状、心肌细胞排列以及心肌正常收缩功能中发挥重要作用[14]。生理情况下，各型胶原蛋白的合成与降解处于一种动态平衡状态；心肌纤维化时，细胞外基质内胶原增生，各型胶原蛋白比例失调，以ColⅠ、ColⅢ的改变最为明显[15]。此外，促纤维化细胞因子与抑纤维化细胞因子的失调也是心肌纤维化的重要调节机制[16-17]。促纤维化细胞因子活化、表达上调，可促进心脏成纤维细胞异常增殖、表型转化，合成大量胶原纤维，进而诱导心肌纤维化。其中，细胞因子TGF-β以及CTGF是各器官、组织纤维化进展中的重要细胞生长因子[18-19]。TGF-β是一类分泌型的多肽细胞生长因子，其功能涉及多类细胞的增殖、分化、凋亡调节等[20]。家族成员TGF-β1主要表达在内皮细胞、造血细胞和结缔组织细胞[21]，可诱导心脏成纤维细胞增殖分化，抑制胶原降解，促进细胞外基质堆积；并可抑制金属蛋白酶生成，增加细胞间黏附，保持肌纤维母细胞生存能力[22]。TGF-β1/Smad 3的激活在心肌纤维化中起重要作用，可诱导心脏成纤维细胞异常增殖及ColⅠ的过表达[23]。家族成员TGF-β2主要表达在上皮细胞和神经细胞[21]。Bao等[24]研究发现，TGF-β2可上调CTGF，致人房水Tenon′s囊成纤维细胞增殖，促进青光眼滤泡瘢痕形成。Ma等[25]发现TGF-β2可诱导CTGF表达上调，致人晶状体上皮细胞增殖，加速白内障进程。目前有关TGF-β2的研究主要集中在眼科学，其在心肌纤维化中作用的研究相对较少。CTGF也是一种分泌型的多功能细胞生长因子，调节细胞外基质稳态，参与血管生成、组织修复、组织器官纤维化的发生发展，是组织器官纤维化的重要标志物之一[26]。研究表明CTGF是TGF-β1的下游调控因子[19]。正常状态下，心肌细胞及心脏成纤维细胞分泌CTGF到心肌间质中，维持一定的基础分泌量；心肌纤维化时，TGF-β1可异常上调CTGF的表达水平，进一步促进胶原蛋白的合成[27]。

目前，临床主要以心脏超声检查结果作为DCM的诊断依据，常以心脏扩大程度来评估病情进展和判断预后。然而，心脏超声检查的准确性有赖于操作者的经验及熟练程度，若单纯以心脏超声结果作为DCM患者病情评估的依据，其可靠性还需斟酌。DCM患者心肌组织中有大量胶原蛋白沉积，因此，目前认为可采用对胶原检测敏感的心脏磁共振T1映射成像与细胞外容积来评估心肌纤维化程度，对DCM患者的疾病进展和预后进行评估，但目前在临床上尚未开展[28]。本研究结果显示，DCM患者心室肌组织中红色胶原纤维沉积明显，CVF增加(P<0.05)，提示DCM患者心肌纤维化严重；同时TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)的mRNA表达水平增加(P<0.05)，且均与CVF水平呈正相关，这提示TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白(ColⅠ、ColⅢ)均在DCM患者心肌纤维化的发生发展中起到重要作用。因此，若对DCM患者行心肌组织活检，测定心肌组织中TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白的表达，可对患者的疾病发展及预后做出更为准确的判断。但在实际临床工作中，愿意接受心肌组织活检的患者数量比较少，检测以上细胞因子在心肌组织中表达的技术很难广泛开展。而TGF-β1、TGF-β2、CTGF作为分泌型细胞因子，其血清表达水平也可一定程度上反映DCM患者心肌纤维化程度，在临床实际中对评估DCM患者疾病转归具有一定的实际意义。此外，TGF-β1、TGF-β2、CTGF和胶原蛋白也可作为抗心肌纤维化药物研究的重要靶点，有助于抗心肌纤维化药物的进一步研发，为控制甚至逆转DCM患者心室重构提供参考依据。