高粱抗丝黑穗病菌4 号生理小种SRAP 标记分析

司浩浩，段永红，孙 毅，张欢欢，张 旭

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

高粱丝黑穗病是一种对作物生产有严重影响的病害[1-3]，是全世界普遍存在的重要高粱病害，该病会对高粱穗部的结构造成破坏，导致高粱减产，甚至会造成颗粒无收[4]。在我国北方地区，尤其是内蒙古和东北三省，丝黑穗病已经成为一种常见病害，严重影响高粱的生产效益[5-6]。因此，高粱丝黑穗病的防治对高粱的安全生产具有重要意义。

高粱丝黑穗病是由孢堆黑粉菌引起的，一般在抽穗期时才能观察到病症，病症最直观的症状是果穗部全部或者大片地变成黑粉状，病株明显比其他植株矮小。其中，发病初期的症状是穗部的下部膨大，打开穗叶后可以观察到白色的棒状物，叫作“乌米”；发病中期，乌米会变大、变硬；发病后期，乌米由白转黑，开始出现黑色丝状物和黑粉，不仅使穗部受损颗粒无收，而且也会感染叶子，使叶子产生条斑，影响植物光合作用，进而影响植物生长。有学者研究认为，高粱丝黑穗病菌不存在分化[7]，但国内外许多研究也发现，高粱丝黑穗病菌包括多个类型，而且分化程度逐渐增大[8-11]。病菌的分化趋势使作物对病菌的抗性减弱，需要不断培育新的抗病品种。

高粱丝黑穗病菌具有显著的分化趋势，新的生理小种的出现会大大降低原有抗病品种的抗性，对高粱收获造成新的威胁。张福耀等[12]研究发现了高粱丝黑穗病菌4 号生理小种，该小种给高粱育种和生产带来严重损失，研究高粱丝黑穗病4 号生理小种相关抗性基因的遗传规律显得尤为重要，急需筛选与抗性基因相关的连锁标记，明确其遗传规律。

本研究选用高粱感病品种三尺三和抗病品系961541 作为试验材料，采用SRAP 标记，从分子水平分析感病植株与抗病植株基因组差异，旨在实现分子标记辅助育种。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验在山西农业大学农作站进行，于2015 年以961541 品系（对1，2，3，4 号生理小种均表现免疫）为母本、以三尺三为父本进行杂交获得杂交种F1，经海南加代获得F2群体。961541 品系和三尺三由山西农业科学院生物技术研究中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 接菌 将高粱父母本及F1、F2群体采用菌土接菌法播种于山西农业大学农作站，于高粱抽穗期调查高粱的感染情况，并计算发病率。

1.2.2 DNA 提取 在苗期对高粱亲本及211 个F2群体单株采样，用CTAB 法（十六烷基三甲基溴化铵法）[13-15]对各单株进行基因组DNA 提取（其基本原理是用物理方法破碎植物细胞，加入CTAB 缓冲液将DNA 溶解出来，再用氯仿- 异戊醇抽提去除蛋白质，最终得到DNA）。CTAB 缓冲液包括4 种主要试剂：12.5 mmol/L 的PEX，100 mmol/L 的Tris- HCl（pH＝8.0），10mmol/L的EDTA（pH＝8.0）和700mmol/L 的NaCl。最后将提取的DNA 溶于适量的TE（pH＝8.0）缓冲液中，于- 70 ℃冰柜中保存。

1.2.3 抗感池的构建 采用分离群体混合分析法（BSA）建立抗感池。根据F2群体单株发病情况，挑选抗病株、感病株各15 株，提取其基因组DNA 后等量混合。分离群体混合分析法是利用相对或极端差异性状进行功能基因挖掘的一种方法，其基本原理是在分离群体中只对目标性状的表现型进行分类，在数量达到一定程度后，抗感池间整体差异最显著的基因即与目标性状连锁的分子标记。

1.2.4 检测DNA 的浓度和纯度 取5 μL 的DNA溶液，用核酸蛋白检测仪测定高粱DNA 的A260/A280值，即得DNA 的纯度和浓度；并用琼脂糖凝胶电泳观察DNA 的质量。

1.2.5 SRAP 标记所用引物来源 17 对上、下游SRAP 引物由上海生工合成，其序列如表1 所示。

表1 SRAP 标记的引物序列

1.2.6 SRAP 标记的扩增 PCR 扩增反应在EDC-810 型基因扩增仪上进行。SRAP- PCR 的最适反应体系（10 μL） 为：DNA 模板1.0 μL、10×PCR Buffer 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.2 μL、dNTPs 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL，ddH2O 6.2 μL。SRAP 的操作过程为：在94 ℃下预变性3 min；在94 ℃下变性1 min，在57 ℃下退火45 s，在72 ℃下延伸1 min，循环35 次；在72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶板的制备 先将冲洗干净的用于制备凝胶板的2 块玻璃板烘干，2 块成对插入胶条中，并固定在电泳仪上，用1.5%的琼脂糖凝胶封胶，静置数分钟待其凝固；然后将制备好的8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（30%非变性聚丙烯酰胺凝胶贮液11 mL；10×TBE 溶液4 mL；双蒸水26 mL；10%的APS 溶液267 μL；TEMED 67 μL）加入烧杯，用玻璃棒搅拌使其充分混匀；最后将其注入到封好口的玻璃板中，插入合适宽度的梳子，竖直放置，直到彻底凝固。

1.2.8 SRAP 标记电泳显色 其参照王运斌等[16]的显色方法进行，在具体的步骤中有所改进。以Marker 为对照，用8%的聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，200 V 恒压下电泳40 min，然后银染显色，使带在胶板上清晰可读。

1.2.9 扩增产物测序与引物DNA 序列比对 在紫外灯下快速将差异片段切下，将DNA 从胶中分离出来，分别以2 个引物采用Sanger 法进行测序。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2003 进行常规计算和统计分析。

2 结果与分析

2.1 田间调查数据分析

田间调查结果显示（表2），种植的三尺三/961541组合中，感病亲本三尺三的发病率为37.5%，抗病亲本961541 的发病率为0，F1的发病率为0；田间种植的F2群体共211 株，其中，感病植株16 株，抗病植株195 株，发病率为7.58%，F2的发病率比较接近1/16，推测4 号生理小种可能受2 对非等位基因控制。适合性检验结果表明（表3），抗感植株比率接近15∶1，χ2值分别是0.027，0.406（P＞0.05），说明高粱丝黑穗病4 号生理小种的抗性受2 对基因控制。

表2 亲本及F2 群体的丝黑穗侵染鉴定

表3 F2 群体性状分离比的适合性检验

2.2 高粱SRAP 标记分析

2.2.1 高粱亲本间多态性引物筛选 所用的289 对SRAP 引物中有119 对引物在亲本间表现差异，多态性引物的总比率为41.18%，119 对引物条带平均多态性比率为37.27%（表4）。其中，引物Em4/Me6 在亲本间扩增的电泳结果如图1 所示。

表4 亲本间引物扩增的多态性

续表4

2.2.2 高粱抗感池间多态性引物筛选 用筛选出的119 对引物在F2构建的抗感池中继续筛选得出，119 对引物中共有9 对引物在抗感池间表现出差异，多态性引物的总比率为7.56%，9 对引物条带的平均多态性比率为53.52%（表5）。

表5 抗感池间引物扩增的多态性

引物Em4/Me6 在抗感池间扩增的电泳结果如图2 所示。

2.2.3 高粱抗感单株间多态性引物验证 用筛选出的9 对引物分别在15 个感病单株DNA 和15 个抗病单株DNA 中进行筛选，结果仅有1 对SRAP引物Em4/Me6 存在差异，多态性引物的比率为11.11%。

引物Em4/Me6 在抗感病单株中扩增的电泳结果如图3 所示。

2.2.4 SRAP 标记筛选结果 选用亲本间有多态性的引物在F2构建的抗感池中继续筛选，筛选出9 对多态性引物在抗感池间有差异；随后用F2单株DNA 验证，结果仅有1 对SRAP 引物Em4/Me6 存在差异。其中，抗池的条带带型与母本961541 相同，感池的条带带型与父本三尺三相同。对上述SRAP 差异片段回收产物进行测序，未成功。失败的原因可能主要是由于DNA 保存时间过长，造成DNA 降解。

3 结论与讨论

3.1 高粱抗丝黑穗病基因遗传规律探讨

目前，已有学者选用RAPD、SSR 等标记研究高粱丝黑穗抗性基因，并得到了不同的研究结果。邹剑秋等[17]采用SSR 技术对3 号生理小种进行研究，结果表明，该小种符合质量性状遗传规律，抗病性受2 对非等位基因控制，并且存在基因互作，筛选出的2 个抗性标记分别位于高粱第2 号、6 号染色体上。OHBJ 等[18]研究表明，美国5 号生理小种的抗病基因位于第8 号染色体上，受1 对基因控制。姜钰等[19]研究表明，3 号生理小种的抗病基因位于第3 号染色体上，抗病性为显性，抗病性受1 对非等位基因控制，抗性差异片段大小约为230 bp。白春明等[3]用SLAF 标记测序和236 个自然群体抗病性鉴定表型，进行了全基因组范围SNP 关联分析，结果表明，主要抗病位点位于第8 号染色体上。

本研究经过亲本间、基因池、单株的共同筛选验证，初步筛选到1 个与抗丝黑穗病相关的SRAP标记，差异片段大小约为250 bp，但由于缺乏锚定标记，没有将差异标记定位到染色体上。本试验结果表明，高粱丝黑穗病4 号生理小种的抗病性受2 对非等位基因控制，符合质量性状遗传，抗病性是显性，感病性是隐性，与杨慧勇等[20]的研究结果相近。但也有学者研究认为，高粱抗丝黑穗病由数量性状遗传控制，还有加性、显性和上位等效应的微弱作用，高粱丝黑穗病菌有多个类型，而且具有严重的分化趋势，其遗传规律仍有待进一步研究。

本试验用4 号生理小种对高粱种质961541 抗病性的研究完善了我国高粱丝黑穗病菌生理小种鉴别寄主体系。众多研究结果显示，不同材料对不同生理小种的抗病基因位点明显不同。所以，今后应该紧密结合分子标记和田间育种，选择更多高粱品种进行杂交，并分析其抗病基因，从而提高品种抗性和育种效率。

3.2 SRAP 筛选与高粱抗丝黑穗病相关标记的实用性分析

LI 等[21]筛选到1 个与中国白菜雄性不育基因相关的SRAP 标记、1 个与油菜恢复基因连锁的SRAP 标记和1 个与芹菜病毒抗性基因紧密连锁的SRAP 标记。潘俊松等[22]采用SRAP 标记方法将黄瓜始花节位性状控制基因定位在第IX 连锁群上。SRAP 标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点，已经被应用于水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物的研究中[23-27]。本研究选用SRAP 技术初步筛选到1 个与高粱抗丝黑穗病相关的SRAP标记，差异片段大小约为250 bp，实现了在实验室内快速鉴定高粱抗丝黑穗病病株。