多模态成像对间充质干细胞移植后活体示踪的应用研究

胡 越，彭 焘，黄明声，姜在波，李名安，贺 立，吴 春

(中山大学附属第三医院介入科 介入放射学研究所，广东 广州 510630)

急、慢性肝功能损伤可由多种因素引起，严重威胁人类的健康，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是具有巨大潜力的新治疗策略[1-2]。相关研究[3-4]表明干细胞自我更新及多向分化的特性有助于肝损伤的修复和再生。但关于干细胞活体示踪技术鲜见报道。为了将干细胞移植更好地应用于临床，研制实时、无创的干细胞示踪成像技术非常重要。本课题组在之前相关研究[5]的基础上将标记荧光素酶和SPION的MSCs移植入急性肝损伤大鼠体内，采用生成像(bioluminescence imaging , BLI)联合MRI对移植MSCs在大鼠肝脏内的动态改变进行多模态示踪，探讨移植MSCs对大鼠急性肝损伤的修复功能。

1 材料与方法

1.1 动物模型 选取雌性SD大鼠90只，体质量350～400 g。由中山大学动物中心提供，批号为SYXK(粤)2012-0081，并通过中山大学实验动物伦理委员会许可。

1.2 仪器与材料 采用GE 1.5T MR扫描仪，活体成像系统由Caliper Life Science提供。聚乙二醇-聚天冬氨酸(聚乙烯亚胺)-超顺磁性氧化铁纳米颗粒载体(PAI/SPION)[4]由中山大学化工学院提供；质粒pDNA(pCMV-Luciferase2-mKate2)由中山大学附属第三医院分子影像实验室提供；低糖DMEM培养基及胎牛血清由Gibco公司提供。标记荧光素酶和SPION的大鼠骨髓MSCs[5]由中山大学附属第三医院分子影像学实验室提供。

1.3 急性肝损伤大鼠模型的制备及MSCs移植 将在橄榄油中稀释的四氯化碳溶液0.5 ml/kg体质量注入90只大鼠腹腔建立大鼠急性肝损伤模型。建模24 h后，经腹腔注射10%水合氯醛溶液(5 μl/g)进行麻醉，无菌条件下经腹部切口分离出肠系膜上静脉。取50只大鼠作为实验组，经肠系膜上静脉将1 ml标记荧光素酶和SPION的MSCs悬液(2×106/ml)缓慢移植入大鼠体内；余40只作为对照组，经肠系膜上静脉注射PBS溶液。在术后1、5、9、10天分别从实验组和对照组各取10只大鼠(共80只)将其脱颈处死，检测血浆中天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST) 和丙氨酸转氨酶 (alanine aminotransferase, ALT)水平，并进行肝组织切片HE染色及免疫组织化学染色。对剩余10只实验组大鼠行体内生物发光成像和MRI。

1.4 体内生物发光成像 ①将荧光素酶底物(300 mg/kg体质量)经腹腔注射入大鼠体内；②吸入异氟烷气体麻醉大鼠，利用活体成像系统观察MSCs移植前及移植后不同时间点(1、5、9、10天)体内MSCs的生物发光成像并实时记录图片，定量分析肝区MSCs的生物发光强度，以photos/sec/cm2/steradian (sr) 为生物发光强度单位。

1.5 体内MRI 经腹腔内注射10%水合氯醛 (5 μl/g) 溶液麻醉大鼠。对MSCs移植前及移植后1、5、9、10天行大鼠肝脏T2*WI。参数：翻转角20°，TR 450 ms,TE 15 ms，FOV 80 mm，矩阵320 ×192，层厚2.0 mm。ROI 设置为300 mm2，测量大鼠肝脏T2WI信号强度,计算标准化信号强度比值。标准化信号强度比值=MSCs移植后大鼠肝脏MR信号强度/MSCs移植前大鼠肝脏MR信号强度。

1.6 免疫组织化学评估 ①大鼠经脱颈处死后切取肝脏，在4%多聚甲醛溶液中固定，随后被石蜡包埋，经切片机切片后置入烘焙箱烤片1 h。②将肝脏组织切片浸入二甲苯溶液3次；然后分别浸入不同浓度乙醇溶液。③PBS溶液清洗后，将切片置入柠檬酸盐缓冲液，微波炉加热后取出室温下自然冷却；滴加1% Triton溶液于肿瘤组织切片，再将切片置入过氧化氢酶阻断剂中浸泡。④PBS溶液清洗后，滴加正常山羊血清封闭液，再滴加兔多克隆抗荧光素酶抗体(由英国Abcam公司提供)，4℃孵育过夜。⑤PBS溶液清洗后，滴加偶联HRP的山羊抗兔抗体，用二氨基联苯胺染色，然后依次将切片置入苏木素溶液、不同浓度乙醇溶液和二甲苯溶液。树脂盖玻片封片，光学显微镜下观察并实时拍照。

1.7 统计学分析 采用SPSS 25.0统计分析软件。计量资料以±s表示。采用独立样本t检验比较实验组与对照组大鼠不同时间AST、ALT水平差异；以配对t检验比较MSCs移植前与移植后不同时间大鼠肝脏生物发光强度以及标准化MR信号强度差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs对肝功能损伤的作用 实验组大鼠血浆和ASTALT水平随时间延长而下降。实验组第5、9、10天血浆AST和ALT水平均低于同一时间点对照组(P均<0.05，表1)。实验组大鼠的肝脏组织切片呈淡染区的范围(即损伤肝细胞)较对照组显著减少(图1)。

图1 MSCs对肝损伤的作用 经肠系膜上静脉注射MSCs(A)或PBS溶液(B)10天后大鼠肝脏组织的变化(HE，×200)

图2 活体生物发光成像 MSCs移植前后，急性肝损伤大鼠活体生物发光成像图

2.2 活体生物发光成像 MSCs移植前以及移植后第1、5、9、10天的活体生物发光强度逐渐下降。MSCs移植后第1天大鼠肝脏区域的生物发光强度较移植前显著增强，然后随时间进程逐渐下降，MSCs移植后第10天，大鼠肝脏区域的生物发光强度几乎检测不到(表2)。病理示肝脏区域的红色范围也随着时间进程逐步缩小(图2)。

2.3 MRI示踪结果 MSCs移植后第1天，大鼠标准化MR信号强度显著下降，此时大鼠肝脏于T2*WI呈显著的阴性成像效果(即变暗征象)，直至移植后第10天，才逐渐恢复到移植前水平(表2、图3)。

2.4 免疫组化结果 肝脏组织切片中，细胞核呈蓝色，褐色表征在MSCs内表达的荧光素酶。荧光素酶阳性的MSCs主要分布在门静脉周围的血窦内。MSCs移植后，随着大鼠肝脏生物发光强度的逐渐下降，荧光素酶阳性的MSCs数目亦随时间进程逐渐减少。MSCs移植后第10天，在肝脏组织切片中基本观察不到褐色的荧光素酶阳性间充质干细胞(图4)。

3 讨论

高效、无创活体成像示踪技术的研制对MSCs移植治疗的发展不可或缺。本课题组在之前相关研究[4]的基础上成功证实了移植的MSCs对大鼠损伤肝脏具有良好的功能修复作用；并成功地将生物发光成像和MRI结合，对移植入大鼠损伤肝脏内的MSCs进行了实时、无创的多模态示踪。

表1 2组大鼠不同时间AST、ALT水平比较(IU/L，±s)

表1 2组大鼠不同时间AST、ALT水平比较(IU/L，±s)

组别AST1天5天9天10天ALT1天5天9天10天MSCs组590.70±4.74352.03±4.08255.25±6.27223.69±1.71275.35±6.10220.11±7.7298.50±4.7947.38±2.02对照组595.17±4.07525.44±3.69505.50±5.84416.12±2.53289.54±7.14275.23±8.50259.26±4.11275.01±7.01t值-0.44-2.74-3.27-3.16-0.82-2.30-3.30-3.44P值0.67<0.05<0.01<0.050.43<0.05<0.01<0.01

图3 MSCs体内MRI示踪 MSCs移植前后大鼠肝脏的T2*WI A～E.依次为MSCs移植前和移植后1、5、9、10天

图4 MSCs移植后大鼠肝脏组织切片的原位免疫组织化学染色 A～E.依次为MSCs移植前和移植后1、5、9、10天，褐色表征MSCs内表达的荧光素酶(×100)

表2 MSCs移植前与移植后不同时间大鼠肝脏生物发光强度、标准化MR信号强度比较

注：*：与移植前比较，P<0.05

本研究成功构建了急性肝损伤大鼠模型。考虑到经门静脉注射可将更多的MSCs移植入大鼠肝脏[6]，肠系膜上静脉的血流主要汇入门静脉，并且肠系膜上静脉注射相对门静脉注射更容易操作。因此，本研究将标记了荧光素酶和SPION的MSCs经肠系膜上静脉注射移植入急性肝损伤大鼠体内。

标记了荧光素酶和SPION的MSCs经肠系膜上静脉注射移植入大鼠损伤肝脏后，大鼠血浆AST和ALT水平呈时间依赖性显著下降，表明MSCs具有修复和抑制急性肝损伤的功能 ，其中的机制可能是MSCs在凋亡过程中释放膜微粒，后者介导的信号传递可用于修复损伤肝组织[7]，亦或是抑制成纤维细胞的增殖与α-平滑肌肌动蛋白的表达，加快基质金属蛋白酶的分泌[8]等。

如活体生物发光成像所示，移植入大鼠损伤肝脏的MSCs表达丰富的荧光素酶，作用于荧光素酶底物产生大量光子，活体成像系统可长期监控MSCs在大鼠损伤肝脏内的定植情况。MSCs移植后，大鼠肝脏生物发光强度随时间进程逐渐下降，在移植后第10天基本上检测不到。生物发光强度与细胞活性密切相关，因为产生光子的酶促反应只能在活细胞中进行。大鼠肝脏生物发光强度的下降或许是由于MSCs迁移出肝脏、局部缺血缺氧导致间充质干细胞死亡[9]、免疫排斥反应[10-11]、很难逃逸肝窦内皮细胞对MSCs的杀伤[12]等。

当标记了荧光素酶和SPION的MSCs经肠系膜上静脉注射移植入急性肝损伤大鼠体内后，经MRI观察到MSCs广泛分布在大鼠损伤肝脏内，于MR T2*WI呈现出显著的低信号强度。连续的MRI观察结果表明定植在大鼠损伤肝脏的MSCs可经MR T2*WI成功示踪，时程长达9天，这与我们之前的研究报道基本一致[13]。肝脏组织切片的原位免疫组织化学染色确认了标记荧光素酶和SPION的MSCs主要分布在门静脉周围及损伤的肝细胞区域，并且干细胞数目随时间进程逐渐减少。

本研究结果显示MSCs移植后，MRI示踪定植在肝脏MSCs的时程较生物发光成像略长。产生这个现象的潜在原因或许是在生物发光成像中，残存的活细胞经酶促反应产生的光子穿过机体深层组织发生能量衰减和散射后，光子强度不足以被活体成像系统检测到，而MR可断层成像，具有不受限制的组织穿透能力，正好弥补了生物发光成像受组织深度影响的缺陷。同时，肝脏组织切片的原位免疫组织化学染色也证实在MSCs移植后第11天，确实有极少数MSCs存在肝脏内。当SPION从移植的MSCs内排出后，SPION会被体内网状内皮系统选择性吸收并参与体内血红蛋白的代谢过程[14]。

本研究结果显示MSCs移植后，BLI和MRI的联合成像成功对移植MSCs在大鼠肝脏内的动态改变进行了多模态示踪。BLI具有无辐射、高敏感度和能够追踪移植后活体细胞生存状态的优点，但是空间分辨率较差，MR扫描可断层成像，具有不受限制的组织穿透能力，正好弥补了BLI受组织深度影响的缺陷，但是对移植后活体细胞生存状态的判断能力差，两者相互弥补，可以达到更好的体内活体细胞的示踪效果。

总之，本研究证实了MSCs具有修复和抑制急性肝损伤的作用，并成功的将BLI和MRI相结合，对移植入大鼠损伤肝脏内的MSCs进行了实时、无创的示踪，在以MSCs为基础的临床治疗及再生医学领域有巨大的应用潜力。