亚临界基质万寿菊残渣中多酚和黄酮超声波辅助提取研究

郭耀东，任嘉瑜，胡莎莎

(1.商洛学院 健康管理学院，陕西商洛 726000；2.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000)

万寿菊(Tagetesspp.)为菊科万寿菊属、1a生草本植物，花色鲜艳并富含叶黄素、多酚、黄酮等多种生物活性物质[1-3]。具有较强的观赏价值、药用价值和经济价值[2,4-6]。近年来，随着中国各地大力实施产业扶贫和乡镇振兴战略，万寿菊种植面积和产量不断扩大。由此形成的万寿菊加工业也已成为带动地方经济发展、实现产业脱贫的支柱产业。目前万寿菊加工主要以发酵、干燥、制备万寿菊颗粒，提取脂溶性叶黄素为主，提取工艺主要为有机溶剂浸提[7]、酶法辅助提取[8]以及超临界CO2辅助提取[9]等。亚临界提取技术以提取温度低、效率高、生物活性成分损失少并易于规模化生产等优点，已成为万寿菊叶黄素提取制备的主要工艺[10-11]。

万寿菊提取制备叶黄素后的副产物-万寿菊残渣中仍含有较为丰富的多酚、黄酮等水溶性活性物质，具有较好的开发利用价值[3,12]。本研究以亚临界提取叶黄素后的万寿菊残渣为研究对象，利用超声波辅助提取技术，通过单因素试验和响应面分析，对超声波提取万寿菊残渣中多酚和黄酮工艺进行优化，获得万寿菊残渣多酚、黄酮最优提取工艺，为实现万寿菊资源多元化综合利用、提升整个产业链附加值提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料和试剂

亚临界提取叶黄素后万寿菊残渣，由陕西森弗天然制品有限公司提供。芦丁、没食子酸标品，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、盐酸等均为分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

750T型多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；ME204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UPR-HW-40L型超纯水机，优普仪器设备公司；KQ-500D型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度、提取功率、提取次数为单因素，分析超声波辅助各因素对万寿菊残渣多酚、黄酮提取效果的影响。

乙醇体积分数：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣 5.0 g，在料液比1∶10(g/mL)、超声功率200 W、50 ℃条件下，分别用体积分数为0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取30 min。

料液比：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣 5.0 g，调节料液比分别为1∶5、1∶15、1∶25、 1∶35、1∶45(g/mL)，在超声功率200 W、50 ℃条件下，用体积分数为80%乙醇溶液提取 30 min。

提取时间：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超声功率200 W、50 ℃条件下，用体积分数为80%乙醇溶液分别提取15、30、45、60和75 min。

提取温度：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超声功率200 W条件下，分别用80%乙醇溶液在30、40、50、60、70和80 ℃下提取45 min。

提取功率：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、50 ℃下，用体积分数为80%乙醇溶液分别在超声功率为100、200、300、400和500 W时提取45 min。

提取次数：称取干燥并粉碎后的万寿菊残渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超声功率300 W、50 ℃条件下，用80%乙醇溶液提取45 min。分别提取1次、2次和3次。

1.3.2 响应面优化试验 根据单因素试验结果，固定料液比1∶35(g/mL)、超声波功率300 W、提取次数1次，选取提取溶剂乙醇体积分数、提取温度和提取时间3个因素，每个因素设置3个水平，利用Design-ExpertV 8.0进行Box-Behnken响应面分析试验[13]。因素水平如表1。

表1 万寿菊残渣中多酚和黄酮提取Box-Behnken响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design for polyphenols and flavonoids extraction

1.4 测定项目及方法

多酚提取率：在张村雪等[14]建立的方法基础上，略有改动，测定样品中多酚质量分数。取没食子酸分析标准品10 mg，用水溶解定容至100 mL，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入福林酚2.0 mL和Na2CO3溶液(75 mg/mL)2.0 mL，定容至10 mL摇匀后放置2 h显色，765 nm下测定吸光度。以没食子酸质量浓度(mg/mL)为横坐标，765 nm下吸光度为纵坐标绘制标准曲线，获得线性回归方程：y=123.27x+0.033 5，R2=0.998 1。将样品提取液稀释不同倍数后，吸取100 μL置于10 mL容量瓶中，按上述方法分别测定吸光度，代入回归方程计算样品中多酚提取率，计算过程中考虑不同稀释倍数。

黄酮提取率：在张村雪等[14]建立的方法基础上，略有改动，测定样品中黄酮质量分数。取干燥芦丁标准品20 mg，用水定容至50 mL，分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶，加入NaNO2溶液(50 mg/mL)0.5 mL，放置 6 min后加入Al(NO3)3溶液(100 mg/mL)0.5 mL，放置6 min后再加入NaOH溶液(40 mg/mL)4 mL，加水定容至10 mL，15 min后于510 nm下测定吸光度。以芦丁质量浓度 (mg/mL)为横坐标，510 nm下吸光度为纵坐标绘制标准曲线，获得线性回归方程：y= 12.494x-0.012，R2=0.999 4。将样品提取液稀释不同倍数后，吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，按前述方法测定吸光度，代入回归方程计算样品中黄酮提取率，计算过程中考虑不同稀释倍数。

2 结果及分析

2.1 超声波辅助提取万寿菊残渣多酚和黄酮单因素试验结果分析

2.1.1 乙醇体积分数 由图1可知，万寿菊残渣多酚和黄酮提取率均随提取溶剂乙醇体积分数增大而上升，当乙醇体积分数为80%时提取率最高，之后多酚和黄酮提取率有所下降。主要原因为通过调节乙醇体积分数使提取溶剂极性发生变化。根据相似相溶原理，提取溶剂与目标提取物质极性接近时，有利于目标提取物质溶出，提取效果更佳[15-16]。因此，选定提取溶剂乙醇体积分数为80%进行后续试验。

2.1.2 料液比 由图2可知，在料液比为1∶35(g/mL)以前，万寿菊残渣多酚、黄酮提取率均随料液比减小而升高。其原因为随着提取溶剂用量增大，万寿菊残渣颗粒与提取溶剂之间接触面积增加，有利于多酚和黄酮两类提取目标物质向溶剂中转移扩散，使提取率升高[17-18]。当液料比达到1∶35(g/mL)时，提取率达到最高，此后，随着料液比减小，多酚、黄酮提取率均有所下降。同时从成本角度分析，提取溶剂用量越多，成本越高。因此，选择料液比1∶35(g/mL)进行后续试验。

图1 提取液乙醇体积分数对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

图2 料液比对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.2 Effects of solid-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.3 提取时间 由图3可知，万寿菊残渣中多酚和黄酮提取率均先随提取时间增加而升高，当提取时间达到45 min时提取率最高，此后，随着提取时间增加，多酚、黄酮提取率均有所下降。其原因可能为随着提取时间增加，在较高温度下，多酚和黄酮受超声波空化效应影响在一定程度上分解，导致提取率下降[16,19]。因此，选择提取时间45 min进行后续试验。

2.1.4 提取温度 由图4可知，万寿菊残渣中多酚和黄酮提取率均随提取温度升高呈现先升高后降低的趋势。30～50 ℃时，多酚、黄酮提取率随提取温度上升而逐渐升高，在50 ℃时达到最大，此后，提取率随提取温度上升有所下降。其原因可能为多酚、黄酮类等生物活性物质对温度较为敏感，在较高温度下有一定程度分解，导致提取率下降[20-21]。因此，选择提取温度50 ℃进行后续 试验。

图3 提取时间对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

图4 提取温度对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.4 Effects of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.5 超声功率 由图5可知，万寿菊残渣多酚和黄酮提取率均随超声功率增大呈现先升高后降低的趋势。在超声功率为100～300 W，多酚、黄酮提取率随超声功率增大而逐渐提升，当超声功率达到300 W时提取率最高，此后，提取率随超声功率增大而有所下降。其原因可能为功率增大使超声波空化作用增强而促进多酚和黄酮有效溶出，但功率过大又会造成多酚、黄酮分解，使提取率降低。因此，选择超声功率300 W进行后续试验[19-20,22]。

图5 超声功率对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.6 提取次数 由图6可知，提取次数为1次、2次和3次时，万寿菊残渣多酚和黄酮提取率差异很小。说明一次提取已能充分提取万寿菊残渣中多酚和黄酮。从成本角度分析，提取次数越多成本越高。因此，选择1次提取进行后续响应面优化试验。

图6 提取次数对万寿菊残渣多酚和黄酮提取效果的影响Fig.6 Effects of extraction times on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.2 超声波辅助提取万寿菊残渣多酚和黄酮响应面优化试验结果分析

2.2.1 响应面优化试验结果 根据单因素试验结果，选择对万寿菊残渣多酚、黄酮提取效果影响较为明显的乙醇体积分数、超声提取时间和提取温度3个因素，进行Box-Behnken响应面优化试验，结果如表2所示。

表2 超声波提取万寿菊残渣多酚黄酮响应面分析结果Table 2 Design and results of response surface analysis for polyphenols and flavonoids extraction from marigold residues

2.2.2 多酚提取响应面优化结果分析及交互作用影响 对表2中万寿菊残渣多酚提取结果进行分析，建立回归方程:Y=-1 861.905 0+ 39.119 0A+9.162 8B+16.684 3C+0.006 2AB- 0.008 8AC-0.034 4BC-0.239 2A2- 0.081 2B2- 0.150 5C2。Y为多酚提取率，A为提取液乙醇体积分数，B为提取时间，C为提取温度。

超声波提取万寿菊残渣多酚响应面试验方差分析结果如表3所示，不同因素交互作用对多酚提取率影响如图7所示。由表3可知，所建立的方程模型具有高度显著性(P<0.000 1)。失拟项不显著(P=0.064 1>0.05)，拟合程度较好(R2=0.994 5，AdjR2=0.987 4)，可以较好反映多酚提取率与提取液乙醇体积分数、提取时间和提取温度之间关系，用于优化万寿菊残渣多酚提取。不同因素中，A、B、A2、B2、C2对万寿菊残渣多酚提取率具有极显著影响(P<0.01)，C对万寿菊残渣多酚提取率具有显著影响(P<0.05)，3个因素之间交互作用对多酚提取率影响均不显著(P>0.05)，说明响应面优化试验所选取的3个因素之间交互作用对多酚提取率影响较弱。

根据建立的回归方程，在选取因素范围内，得到超声波提取万寿菊残渣多酚最优工艺参数为：乙醇体积分数81.54%，提取时间49.49 min，温度47.39 ℃，在此条件下得到的多酚理论提取率为354.86 mg/g。

表3 超声波提取万寿菊残渣多酚响应面方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted regression model for polyphenols extraction from marigold residues

注：**表示差异极显著，*表示差异显著。下同。

Note:** show extremly significant difference,* significant difference.The same below.

图7 不同因素对万寿菊残渣多酚提取效果交互作用影响Fig.7 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of polyphenols from marigold residues

2.2.3 黄酮提取响应面优化结果分析及交互作用影响 对表2中万寿菊残渣黄酮提取结果进行分析，建立回归方程:Y=-481.525 0+ 5.957 5A+8.880 5B+9.440 8C+0.010 6AB+ 0.000 7AC-0.008 1BC-0.041 0A2- 0.093 5B2-0.090 3C2。Y为黄酮提取率，A为提取液乙醇浓度体积分数，B为提取时间，C为提取温度。

超声波提取万寿菊残渣黄酮响应面试验方差分析结果如表4所示，不同因素交互作用对黄酮提取率影响如图8所示。由表4可知，所建立的方程模型具有高度显著性(P< 0.000 1)。失拟项不显著(P=0.154 6>0.05)，拟合程度较好(R2=0.990 3，AdjR2=0.977 8)，可以较好反映黄酮提取率与提取液乙醇体积分数、提取时间和提取温度之间关系，用于优化万寿菊残渣黄酮提取。不同因素中，B、A2、B2、C2对万寿菊残渣黄酮提取率具有极显著影响(P<0.01)，3个因素之间交互作用对黄酮提取率影响均不显著(P>0.05)，说明响应面优化试验所选取的3个因素之间交互作用对黄酮提取率影响较弱。

根据建立的回归方程，在选取因素范围内，得到超声波提取万寿菊残渣黄酮最优工艺参数为：乙醇体积分数79.46%、提取时间49.81 min、温度50.33 ℃，在此条件下得到的黄酮理论提取率为 214.01 mg/g。

表4 超声波提取万寿菊残渣黄酮响应面回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for fitted regression model for flavonoid extraction from marigold residues

图8 不同因素对万寿菊残渣黄酮提取效果交互作用影响Fig.8 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of flavonoids from marigold residues

2.2.4 多酚和黄酮最优工艺参数确定 以多酚、黄酮提取率最大化为目标，对万寿菊残渣多酚、黄酮提取结果进行综合分析。并考虑提取工艺实际可操作性，对前述得到万寿菊残渣多酚、黄酮类物质最优工艺参数进行修正，按照乙醇体积分数为81%、提取时间50 min、提取温度49 ℃的条件进行5次平行验证性试验。最终多酚平均提取率为356.67 mg/g、黄酮平均提取率为216.04 mg/g，与理论提取率接近。证明本研究建立的万寿菊残渣提取多酚、黄酮回归模型的有效性。

3 结论与展望

本研究以亚临界提取制备叶黄素后的副产物万寿菊残渣为原料，利用超声波辅助提取技术，通过单因素试验和Box-Benhnken响应面优化试验，得到多酚和黄酮的最优提取工艺参数：乙醇体积分数81%、提取时间50 min、提取温度49 ℃、料液比1∶35(g/mL)、超声功率300 W。在此条件下，万寿菊残渣多酚和黄酮提取率分别为 356.67 mg/g和216.04 mg/g，能够提取得到绝大多数的多酚、黄酮等水溶性生物活性物质。

本研究优化得到的万寿菊残渣中多酚、黄酮提取率相对其他文献较高，其原因可能为本研究所用原料为亚临界提取制备叶黄素后的残渣[23]。一方面，亚临界萃取对脂溶性物质具有良好的提取效果，使万寿菊颗粒中叶黄素等脂溶性物质能够最大限度浸出，剩余水溶性活性物质更加富集[24]。另一方面，亚临界对提取基质具有较好的粉碎孔化作用，能够在一定程度上促进提高活性物质的提取分离效率[24]。研究结果说明亚临界提取叶黄素后的万寿菊残渣中含有丰富的多酚、黄酮等水溶性生物活性物质，具有广阔的开发利用前景和价值。

万寿菊植物多酚、黄酮类成分复杂、种类多样，且二者在较大程度上交叉存在[5,25-26]。本研究团队下一步将在此基础上，对万寿菊残渣中多酚、黄酮类物质进一步分离、纯化、鉴定，探究并阐明多酚、黄酮类物质的具体化学结构和组成。