16S rRNA测序法检测仓鼠颊囊内细菌种类的研究

陈璟恒 张芙蕊 李和平

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

16S rRNA分子是研究细菌群落最佳靶分子，利用保守区序列设计通用引物来进行PCR扩增，利用可变区序列来进行种属分类[1]。目前，16S rRNA 测序是研究肠道微生物的重要方法之一，该方法可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量，因此正逐渐成为研究肠道微生物菌种丰度变化的主流[2]。

动物的颊囊，又称食囊，是灵长目(Primates)的猕猴(Macaca)和啮齿目(Rodentia)的松鼠(Sciuridae)、蒙古黄鼠(Spermophilusdauricus)、仓鼠(Cricetidae)等动物的口腔内两侧的一种特殊的囊状结构。灵长目动物的颊囊主要用于贮藏食物[3]，单孔目(Monotremata)动物鸭嘴兽(Ornithorhynchusanatinus)的颊囊作用特殊，用于收集细小的砂石，帮助其磨碎几丁质或者其他坚硬的食物[4]。仓鼠的颊囊除储存作用之外，还充当气囊，当仓鼠落水时，便会在颊囊中充气，形成气囊，能够让其把头露出来游泳[5]。动物的消化道中栖居着大量微生物，它们参与饲料的分解和转化作用[6]。在仓鼠颊囊中，其微生物(细菌菌落)栖居情况尚不清楚，因此，为了探明其微生物种类，本研究利用16S rRNA 测序技术，通过分析仓鼠颊囊微生物菌种丰度变化，来确定仓鼠颊囊内细菌种类，为仓鼠颊囊内食物的消化生理作用提供基础的科学参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物

购自哈尔滨市大发市场实验用仓鼠5只。

1.2 试验方法

1.2.1 颊囊液体提取

将仓鼠进行口腔局部解剖，剥离出仓鼠的颊囊，并保证颊囊不破裂，用BIORISE公司的OC-100 DNA样本采集袋(含口腔拭子)插入仓鼠颊囊，并进行擦拭，待口腔拭子沾满颊囊内液时，迅速将口腔拭子插入装有1 mL唾液保存液的唾液DNA收集器中。

1.2.2 16S rRNA提取及物种分析

将被仓鼠颊囊内液体浸湿的口腔拭子插入上海朗赋生物科技有限公司生产的SAL2000L唾液样本采集管中，让拭子充分浸入唾液保存液中，立刻放入液氮罐中速冻后，送往深圳市华大基因有限公司测序。

2 结果与分析

对粘有仓鼠颊囊液体的口腔拭子进行细菌的16S rRNA测序，并对细菌种类进行注释分析。测序结果如表1所示，放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)占到了所鉴定菌群的三分之二，是最具有优势的菌门。γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)在所鉴定的菌群中占比也超过三分之二，是最具优势的菌纲。在细菌目水平，棒状菌目(Corynebacteria)和乳杆菌目(Lactobacillales)以及丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)是最高频菌目，其他菌目比例较低。在细菌科水平，最具优势的菌科分别为棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)。德克斯氏菌属(Derxia)、颗粒链菌属(Granulicatella)、乳杆菌属(Lactobacillus)是现已知分类的最具优势的菌属。

表1 仓鼠颊囊内细菌种类及其丰度

Tab.1 The sorts and abundances of bacteria from hamster’s cheek pouches

3 讨论

仓鼠的主要食物为蔬菜类、谷物类、种子类、蛋白质类，以谷物和少许豆类为主[7]。从颊囊的物理性质以及仓鼠的食性判断，颊囊并不具备通过扭转等作用，将食物挤压、磨碎的功能，仓鼠也不会像鸭嘴兽一样在颊囊中储存细小的砂石，通过砂石磨碎几丁质与坚硬的农作物外壳[4]。

通过对仓鼠颊囊内液体进行的16S rRNA细菌菌群分布结果可以看出，仓鼠的颊囊中含有拟杆菌属(Bacteroides)、色杆菌属(Chromobacterium)、乳杆菌、德克斯氏菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)等。其中乳杆菌包括了双歧乳杆菌种(Lactobacillus_animalis)、仓鼠乳杆菌种(Lactobacillus_hamsteri)、口腔乳杆菌种(Lactobacillus_oris)，乳杆菌具有分解糖类底物，产生各种功能性酶的作用[8]，因此这3种乳杆菌均对食物具有一定的消化作用。

乳杆菌在肠道中可有利于恢复肠道正常微生物群体的生态平衡，促进消化和营养物质的吸收[9]。肠道中的双歧杆菌则可以调整菌群[8]，并分泌多种酶促进铁、钙和维生素的吸收，某些产物还能改善蛋白质的代谢[10]。由于仓鼠将食物放在颊囊中的时间和颊囊中微生物含量是有局限性的[11]，因此可推断，仓鼠颊囊对食物并没有直接的消化作用或消化作用不明显，但食物在颊囊这个非干燥条件下的贮存，可以对食物之后的咀嚼与消化起到促进作用。