基于16S rRNA基因白眉长臂猿属物种鉴定研究

胡桓嘉 滕 萍 李 媛 番玉买 李宏刚 王勒端 段玉宝*

(1.德宏州野生动物收容救护中心，德宏，678400；2.西南林业大学，云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；3.西南林业大学生物多样性保护学院，昆明，650224)

分子生物学技术目前已经广泛应用于物种鉴定及系统发生分析，动植物及微生物的遗传多样性研究也有涉及，常用作分子标记的基因有细胞色素C氧化酶I亚基(COI)、细胞色素b(Cytb)、16S rRNA基因等[1-3]。通过测定DNA序列对物种进行鉴定具有快速、准确等特点，16S rRNA较为保守，进化速率相对较低，可利用通用引物扩增，适合进行物种鉴定[4]。16S rRNA基因已广泛应用在哺乳动物、爬行动物、鱼类以及无脊椎动物的种属鉴定、亲缘关系、遗传多样性等研究中[2，5-7]。

白眉长臂猿属(Hoolock)隶属于灵长目(Primates)长臂猿科(Hylobatidae)，现存3个物种分别为西白眉长臂猿(Hoolockhoolock)、东白眉长臂猿(H.leuconedys)和高黎贡白眉长臂猿(H.tianxing)[8-10]。其中高黎贡白眉长臂猿是2017年由我国学者命名的新种，从东白眉长臂猿中分离出来，两者成年个体在眉毛、胡子及眶下毛发存在差异[8]。之前我国分布的东白眉长臂猿，和高黎贡白眉长臂猿实为同物异名，是国家 Ⅰ 级保护动物，被世界自然保护联盟(IUCN)列为易危物种(VU)。长臂猿属物种幼年个体其鉴别并不明显，鉴别时存在困难。因此，本研究基于16S rRNA对白眉长臂猿属3个未知物种进行分子生物学鉴定，检验该基因在灵长类物种鉴定上的可行性，并为灵长类物种的司法鉴定提供理论依据。

1 研究材料

研究材料采自云南省德宏州野生动物收容救护中心救护的3个白眉长臂猿属物种幼体，均由当地森林公安罚没救助(表1，图1)。通过口腔拭子采集3个物种的唾液，分布标记为B1、B2、B3，装进保存管后立即运回实验室，置于-20℃冰箱冷冻保存。

表1 3个物种的基本信息

Tab.1 Information on three species of Hoolock genus

图1 3个待鉴定的白眉长臂猿属物种(从左及右分别是B1，B2，B3)Fig.1 Three species of Hoolock genus(From left to right are B1，B2 and B3)

2 研究方法

2.1 DNA提取

DNA提取通过使用自上海生工生物工程技术有限公司购买的Ezup 柱式唾液、尿液基因组DNA 抽提试剂盒完成。取适量唾液样品，装入1.5 mL离心管中，DNA提取方法参阅试剂盒所带说明书，收集的DNA溶液置于-20℃冰箱保存。

2.2 PCR扩增及测序

PCR扩增引物参考Kocher(1989)和Suwannapoom(2017)的引物16Sar(5′-CGCCTGTTTAYCAAAAACAT-3′)and 16Sbr(5′-CCGGTYTGAACTCAGATCAYGT-3′)[11-12]。采用普通PCR对提取的DNA进行扩增，反应体系为50 μL：TaqPCR Master Mix 7.5 μL，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，模板1 μL(20—50 ng/μL)，加37.5 μL ddH2O补足。PCR反应程序为：95℃预变性3—5 min，94℃变性30 s，55—60℃复性25—30 s，72℃延伸30—50 s，72℃再延伸5—8 min，35个循环。引物合成和扩增产物测序均由上海生工生物工程技术有限公司完成。

2.3 序列处理

首先使用Seqman检验所得目的序列，切掉两端信号较差的峰图；然后在NCBI上进行BLAST相似性比对，对所得序列进行初步鉴定。参考下载白眉长臂猿属物种序列(表2)，使用MEGA7.0对所有序列进行比对，剪切整齐之后保存为FASTA文件[13]。利用ClustalX 1.83将FASTA文件另存为NEXUS文件，DAMBE 5.2.31对所有序列进行饱和度检验[14-15]。

设置西白眉长臂猿为外群，PAUP 4.0进行系统发育树估算[16]。利用MrBayes v3.1.2构建贝叶斯树，jModeltest估算核苷酸替代模型，设置贝叶斯核苷酸替换类型nst为6，位点间变异速率分布rates为invgamma，运行马尔科夫链150 000，每100代取样1次，运算完成后标准误差小于0.01[17-18]。最后将PAUP 4.0估算的系统发育树与贝叶斯树的拓扑结构合并分析，用PPT(Microsoft PowerPoint 2010)进行美化。

表2 白眉长臂猿属线粒体基因组的GenBank检索号和序列来源

Tab.2 The accession number and the resources of sequences of Hoolock

3 结果

3.1 序列比对及检验结果

在NCBI中的BLAST比对结果显示，B1与东白眉长臂猿(GenBank序列号：KY250071.1)的同源性为100%，B2与高黎贡白眉长臂猿(GenBank序列号：KY250070.1)的同源性为100%，B3与东白眉长臂猿(GenBank序列号：KY250074.1)的同源性为99.61%，初步认为B1、B3为东白眉长臂猿，B2为天行长臂猿。

3.2 系统发育分析

对序列的检验结果显示，Iss=0.006 6

图2 基于16S rRNA基因构建白眉长臂猿属物种的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees construction of Hoolock based on 16S rRNA gene

4 讨论

目前，非人灵长类动物的种群现状受到严重威胁，能够准确鉴定物种种类对于其救助、放归具有重要意义。东白眉长臂猿和高黎贡白眉长臂猿在外部形态上较为相似，成年雄性在两眉毛间距离、眉毛浓重程度、胡子及生殖腺上毛的颜色来区别；而成年雌性眼周(特别是眼睛两侧、眼下)白色毛发的多少或有无，作为鉴别特征[8，19]。但是幼体或者亚成体，形态特征特别是毛的颜色并不稳定，无法准确识别到物种级别。例如：高黎贡白眉长臂猿亚成体的眼下无白色毛发，而部分东白眉长臂猿幼体的眼下，也无白色毛发，故通过形态辨别白眉长臂猿的幼体或亚成体并不科学严谨。

线粒体DNA的16S rRNA基因进化速度较低，是线粒体基因中适合种及以上水平的分子系统学研究，在哺乳动物(如蜂猴属Nycticebus、鹅喉羚Gazellasubgutturosa)物证鉴定中成功应用[2，20]。虽然16S rRNA 基因存在一定的缺陷，存在比COI通用序列更为有效的DNA 条形码区域[21]。例如，王冬亮等运用16S rRNA 基因鉴定了牛肉干样品中肉品来源，其中65%的产品非来自食肉牛肉，损害了消费者的利益[22]。本次系统发育的聚类结果与BLAST结果一致，系统发育树显示两种白眉长臂猿形成两个姐妹支，支持率也达到100%，进一步证实了16S rRNA在非人灵长类物种鉴定上的可行性。