植物乳杆菌对牦牛肌肉蛋白提取物的降解能力研究
2019-11-16刘保丁捷白婷周智威李洋何江红孙群
刘保 丁捷 白婷 周智威 李洋 何江红 孙群
摘要：为探究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对牦牛肌肉蛋白提取物的降解能力，以自然发酵牦牛酸醡肉中分离的4株植物乳杆菌为发酵菌株，分别构建肌浆蛋白和肌原纤维发酵模拟体系。结果表明，在发酵过程中，接种4株植物乳杆菌均能使肌浆蛋白的磷酸化酶和肌红蛋白以及肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链和肌动蛋白在内的多个条带降解消失，其中植物乳杆菌M2降解肌原纤维蛋白效果最好。两种发酵模拟体系中接种组的游离氨基氮含量均显著大于对照组（P<0.05），以肌原纤维发酵模拟体系中M2处理组最高。综上，植物乳杆菌M2具有较强降解牦牛肌肉蛋白，特别是肌原纤维蛋白的能力，有望用于后续牦牛酸醡肉功能发酵剂的开发。
关键词：植物乳杆菌;牦牛肉;肌肉蛋白;蛋白降解
中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）10-0071-07
收稿日期：2019-05-15;收到修改稿日期：2019-06-23
基金项目：四川省科技支撑计划（2016NZ0005）
作者简介：刘保（1992-），男，安徽颖L县人，硕士研究生，专业方向为资源微生物学。
通信作者：孙群（1967-），女，四川成都市人，教授，博士，研究方向为微生物技术与食品安全。
0 引言
发酵肉制品是在自然或人工条件下，由乳酸菌等益生菌以及其他环境微生物通过发酵作用而形成，具有较长的保质期，且营养价值较高[1]。乳酸菌作为主要发酵菌种，不仅可抑制腐败菌的生长，还可赋予肉制品特殊的风味、色泽和质地[2]。发酵肉制品中常用的乳酸菌包括弯曲乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、清酒乳杆菌等[3]。其中，植物乳杆菌广泛应用于发酵香肠、腊肉、酸肉等发酵肉制品工艺中[4]。黄忠白[5]、裘迪红[6]等研究发现利用植物乳杆菌发酵水产品具有去腥增香的效果。车振民等[7]发现植物乳杆菌发酵风干牛肉干的色泽、硬度、咀嚼性得到显著改善。陈曦等[8]研究发现添加植物乳杆菌发酵香肠不仅使香肠的微生物安全性和感官品质明显提高，同时还降低了水分活度，延长了香肠的保质期。
蛋白质的降解过程对于发酵肉制品成熟起到至关重要的作用。肌肉蛋白质尤其是肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解作用通常是由肌肉内源蛋白酶和微生物蛋白酶共同协作完成[9]。降解过程中肌肉内源性蛋白酶起主要作用，微生物酶则在蛋白水解后期发挥重要作用，如胞内的氨肽酶、二肽酶和三肽酶等[10]。大分子蛋白降解为多肽后，微生物酶将多肽进一步水解为短肽和游离氨基酸，多数氨基酸又可进一步形成风味物质或者风味前体物质，再通过微生物的一系列生化反应最终生成醛、酸、醇和酷等芳香化合物，赋予肉制品独特的风味和质地[11-12]。牦牛肉营养价值极高，具有高蛋白低脂肪富含氨基酸等特点，但其肉质较老，口感粗糙，硬度较大严重限制了其开发利用[13]。植物乳杆菌具有较为完善蛋白水解系统，利用植物乳杆菌发酵有望对牦牛肉品质嫩度进行改善，同时赋予其新的风味[14-15]。
牦牛酸醡肉是以新鲜牦牛肉为主料，辅以青棵粉及多种调味料经自然发酵而成，同时结合了牦牛肉和发酵肉的优点，营养价值极高且风味独特，并对提高牦牛肉嫩度有明显作用[16]。本课题组前期从自然发酵的牦牛酸醡肉中分离筛选到4株具有蛋白酶活性的植物乳杆菌，为探究该4株乳酸菌对耗牛肌肉蛋白的降解能力，本研究以新鲜牦牛肉为材料，构建体外发酵模拟体系筛选降解牦牛肌肉蛋白能力较强的菌株，以期为后续牦牛酸醡肉的发酵剂开发及品质研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与样品
菌株：植物乳杆菌M2、M4、M5、M6分离于自然发酵成熟的牦牛酸醡肉。
牦牛肉样品：牦牛背最长肌，购于四川省甘孜州白玉县农贸市场。
1.1.2 主要试剂
氯化钠、磷酸氢二钠、碘化钾、三氯乙酸、磷酸二氢钠、四硼酸钠、葡萄糖等购于成都金山化学试剂有限公司;宽范围彩色预染蛋白质Marker购于北京天根生化科技有限公司;邻苯二甲醛、10% SDS溶液、牛血清蛋白、5×蛋白上样缓冲液、TritonX-100等购于北京索莱宝科技有限公司;苯丙氨酸购于上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 仪器与设备
WF2212112型匀浆机，美国Waring公司;高速台式冷冻离心机，德国艾本德公司;PowerBacTMBasic电泳仪，Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司;PH计，上海仪电公司;恒温水浴锅，上海跃进医疗公司;紫外分光光度计，日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株悬浮液制备
将植物乳杆菌M2、M4、M5、M6分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养16h，活化传代2次。将培养后的菌种发酵液在4℃，8000g条件下离心10min，弃日青，并将菌体沉淀懸浮于0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）中，离心（4℃，8000g，10min）弃上清，重复2次上述操作后，再悬浮于0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）中，同时在600nm处测定OD值，以0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）为空白对照，将各菌株菌悬液调至相同OD值约为0.9，即得到各株乳酸菌的菌悬液。
1.2.2 肌肉蛋白提取物制备
肌浆蛋白的提取参照Fadda的方法[ly]，即取耗牛肉背最长肌10g，用无菌蒸馏水冲洗3次后加入10倍体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）匀浆3min，然后在4℃，10000g条件下离心20min，吸取上清液用滤纸片进行过滤，滤液再用0.22μm滤膜过滤除菌，即得肌浆蛋白提取液。
肌原纤维蛋白提取参照Sanz的方法[18]，将上述步骤肌肉蛋白沉淀悬浮于10倍体积的0.03mol/L、含0.1%（v/v）TritonX-100的磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，匀浆2min，然后在4℃，10000g条件下离心20min，弃上清，重复上述操作3次，清洗沉淀以除去肌肉蛋白酶。沉淀称量，并悬浮于9倍体积的0.1mol/L、pH6.5的磷酸盐缓冲液（含0.7mol/LKI）中，匀浆4min，10000g、4℃离心20min，上清液透析并过滤除菌后，用无菌水稀释6倍，即得肌原纤维蛋白提取液。
利用双缩脲法分别测定肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取液中的蛋白质浓度，并以牛血清蛋白（BSA）作为标准品绘制标准曲线。
1.2.3 模拟体系的构建
取各株乳酸菌的菌悬液5mL分别添加于45mL的肌浆蛋白提取液或肌原纤维蛋白提取液中（含有0.1%葡萄糖），混匀;另做一空白对照，即不接种乳酸菌，添加5mL 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.5）。将各组样品置于30℃培养箱中培养。分别在第0，2，4，6d取出适量体积的发酵液，并做下一步分析测定。
1.2.4 活菌数及PH值测定
在不同发酵天数的肌浆蛋白发酵液和肌原纤维蛋白发酵液中取适量的发酵液进行梯度稀释，选取合适的稀释浓度涂布于MRS固体培养基平板上，37℃倒置培养48h后，进行菌落计数。同时用PH计测定各组发酵液的PH值。
1.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳
取80μL不同发酵天数的肌浆蛋白发酵液或肌原纤维蛋白发酵液添加20μL5x蛋白上样缓冲液，充分混匀，置于100℃水浴加热5min，待冷却至室温后，10000r/min离心3min，各组样品吸取上清液20μL，进行电泳。浓缩胶浓度为5%，电压为80V;分离胶浓度为12%，电压为120V。电泳结束后，将凝胶放于考马斯亮蓝R-250染色液（0.1考马斯亮蓝R-250、25%异丙醇和10%冰乙酸）中染色2h，取出凝胶，蒸馏水冲洗几次，然后倒人脱色液（85%蒸馏水、10%冰酯酸和5%无水乙醇）中，过夜脱色，直至背景清晰，再置于凝胶成像仪拍照。
1.2.6 游离氨基氮测定
发酵模拟体系中游离氨基氮含量的测定利用邻苯二甲醛（OPA）比色法来进行[19-20]。先称取40mg邻苯二甲醛溶于1mL的甲醇中，再分别加入25mL 0.1mol/L的四硼酸钠溶液、2.5mL 20%SDS溶液和100μLβ-琉基乙醇，最后加入蒸馏水定容至50mL，即得到邻苯二甲醛衍生试剂。OPA试剂需现用现配。以苯丙氨酸作为标品，制备不同浓度的苯丙氨酸标准溶液各150μL加入3mLOPA试剂，混合均匀后，置于室温反应2min，然后于340nm测定吸光度值，根据结果绘制标准曲线。
取0.5mL不同发酵天数的肌浆蛋白发酵液或肌原纤维蛋白发酵液加入1mL12%三氯乙酸溶液（TCA）溶液，混合均匀，室温静置10min，待出现蛋白沉淀后，2000r/min离心10min。取上清液150μL加入3mL OPA试剂混合均匀，然后放置于室温反应2min，并在 340mm处测定吸光度值，最后根据标准曲线，计算游离氨基氮的浓度。
2 结果与分析
2.1 發酵模拟体系中乳酸菌的生长变化
如图1所示，4株植物乳杆菌在两种发酵模拟体系中的活菌数均呈现逐步下降趋势，各接种组的发酵初始活菌数约为108CFU/mL，发酵至第6天，活菌数降至107CFU/mL左右。由于发酵液中蛋白分解的小肽和氨基酸可为植物乳杆菌提供少量的碳源，所以菌体可在发酵体系中存活;但随着发酵时间延长，由于肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取液中营养物质以氮源为主，碳源严重不足，所以植物乳杆菌的总菌数呈逐渐下降的趋势。Fadda等研究了植物乳杆菌CRL681对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取物的水解能力，发现接种培养%h后，乳酸菌活菌数明显下降[21]。孙雷[22]、Chen[23]、Sanz[24]等的研究结果也与此类似。
2.2 发酵过程中pH值的变化
肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发酵模拟体系中pH值的变化如图2所示，两种发酵模拟体系的初始pH一致，在整个发酵过程中，未接种的对照组pH值均保持稳定。在发酵的前2天，两种体系中乳酸菌利用有限营养资源代谢产生有机酸，而致使pH值分别下降至4.4和42，随后的几天内，pH变化差异不显著（P>0.05）。从图2（a）可以看出，在发酵的中后期，肌浆蛋白发酵模拟体系中pH值出现轻微上调，可能是由于营养物质有限以及蛋白水解产生的氨基酸和多肽被菌体消耗产生非蛋白含氮化合物和氨的累积所致[25]。肌原纤维蛋白发酵模拟体系中pH值在发酵后期并未升高，可能是因为菌株的产酸速率要大于非蛋白含氮化合物和氨的累积速率。
2.3 发酵过程中肌肉蛋白的降解
分别接种4株植物乳杆菌培养0，2，4，6d的肌浆蛋白电泳图谱如图3所示，在培养前，对照组与各接种组的肌浆蛋白电泳条带无明显差异，起始条件接近。当发酵至第2天时，如图3（b）所示，与对照组相比，肌浆蛋白中磷酸化酶（98kDa）和肌红蛋白（17kDa）对应条带几乎消失，M型肌酸激酶（42kDa）和甘油醛脱氢酶（35kDa）对应条带强度变弱，其他多个条带强度变弱或消失，表明肌浆蛋白发生了降解。随后4天发酵时间内，接种组蛋白条带强度进一步减弱。在发酵至第6天，如图3（d）所示，接种组蛋白条带颜色已经变得很浅，多处条带已消失。而在整个6天发酵周期内，对照组条带未有明显变化，表明肌浆蛋白未发生降解反应，因此接种的4株植物乳杆菌均可促使肌浆蛋白降解，但无明显差异。
肌原纤维蛋白电泳图变化如图4所示，在培养前对照组与接种组的肌原纤维蛋白电泳图条带无明显差异。当发酵进行到第2天时，如图4（b）所示，与对照组相比，所有接种组的蛋白条带强度明显减弱，表明肌原纤维蛋白有所降解。在发酵第4天时，接种组肌原纤维蛋白条带强度进一步减弱或消失，尤其肌球蛋白重链（MHC，220kDa）和肌动蛋白（45kDa）条带强度出现较大程度的减弱，其中接种M2组MHC条带已经降解消失。在发酵第6天，对照组蛋白条带相比于培养前强度略为减弱，而接种组肌原纤维蛋白条带强度微弱，几乎消失，尤其接种M2组更为明显，肌动蛋白（45kDa）、肌钙蛋白-T（37kDa）以及原肌球蛋白（35kDa）已经降解消失。从图中可以看出，在4个接种组中接种M2组降解肌原纤维蛋白效果最好。
近年来，多项研究表明乳酸菌具有降解肌肉蛋白质的能力。Chen等[23]研究发现戊糖片球菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌以及发酵乳杆菌均可降解肌浆蛋白提取物。Fadda VZ‘]砂移乙显示{彭孵日干菌CRL681全细胞胞对肌浆蛋白具有较强水解作用，而对肌原纤维蛋白水解作用较弱。Sanz[24]、孙雷[22]等研究也表明植物乳杆菌可降解肌肉蛋白质。本研究中，由图3和图4可以看出，对照组条带未发生明显降解，也即排除肌肉内源蛋白酶的作用，肌肉蛋白的降解主要是由植物乳杆菌作用引起。
2.4 游离氨基氮分析
蛋白酶在分解蛋白质的氨基或羧基末端肽键后，可导致氨基态氮的累积，游离氨基氮测定的是蛋白质经水解产生的小肽和氨基酸，通过对游离氨基氮的测定可反映发酵模拟体系中蛋白酶的活力情况[26]。此外，由蛋白降解生成的小肽和游离氨基酸对肉制品的香味和滋味的形成也具有重要的贡献。
肌浆蛋白发酵模拟体系中游离氨基氮的变化如图5（a）所示，在发酵的6天内，对照组的游离氨基氮无显著增加，说明肌浆蛋白并无水解现象，结果同图3肌浆蛋白电泳图谱变化。而接种组游离氨基氮含量随着发酵时间的延长而升高，在发酵第6天，接种组游离氨基氮含量显著大于对照组（P<0.05），各接种组之间无显著差异（P>0.05）。
如图5（b）所示，肌原纤维蛋白发酵模拟体系中游离氨基氮含量变化趋势与肌浆蛋白发酵模拟体系基本一致，发酵第6天后，对照组游离氨基氮含量小幅增加，接种组游离氨基氮含量仍显著高于对照组（P<0.05），其中接种M2组游离氨基氮含量略高于其他3个接种组。结果表明，在发酵模拟体系中植物乳杆菌促使肌肉蛋白降解产生小肽和游离氨基酸，与上述肌肉蛋白降解电泳图谱变化结果一致。
3 结束语
由电泳图谱可以看出，4株植物乳杆菌均显示出降解肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的能力，此外接种4株植物乳杆菌可促使肌肉蛋白分解产生小肽及氨基酸的累积，其中M2菌株降解肌原纤维蛋白效果最佳，其他3株无明显差异。后续还可继续对该植物乳杆菌的蛋白水解酶进行深入的探讨。综上，可得出植物乳杆菌M2综合降解能力最强，具有潜在改善耗牛肉品质嫩度，增添风味的潜力，并有望用于后续牦牛酸醡肉的开发。
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（編辑：莫婕）
