基于SSR分子标记的普通菜豆种质遗传多样性分析

夏春阳 杜吉到 韩毅强 孙浩月 李 明 吴洪斌 张 琦 于晟龙

(黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319)

普通菜豆又名芸豆、四季豆，属豆科蝶形花亚科菜豆族菜豆属菜豆种，是菜豆属重要的栽培种之一[1]。中国普通菜豆的主产区主要分布在黑龙江、内蒙古、吉林、云南、贵州、山西、陕西等地。普通菜豆适应性强在世界范围内均有种植，是最受消费者欢迎的食用豆类作物之一[2]，成熟普通菜豆经过加工后可以制成豆沙或者糕点等，未达到成熟时期的可作为蔬菜食用。普通菜豆籽粒中蛋白质含量为17%～23%，脂肪含量为1.3%～2.6%，碳水化合物含量为56%～61%[3]，还含有矿物质以及多种维生素，在欠发达国家和地区，菜豆可供人们直接食用，并且是人们膳食结构中重要的组成部分[4-5]。

目前中国对菜豆种质资源研究包括对现有的资源进行系统的形态鉴定；对部分菜豆种质资源进行抗病虫、抗逆性试验鉴定，首先筛选出一部分优质种质资源，对菜豆特殊功能成分进行提取及分析[6]。Lei等[7]对233份菜豆进行形态多样性鉴定，并筛选出183份优异种质。Blair等[8]和栾非时等[9]分别对323份芸豆和60份芸豆基于形态性状进行聚类分析，分别划出2个类群与3个类群。遗传多样性是指在群体内个体间基因组成的差异，这是一个种群和一个物种中的遗传基础，一个种群的遗传多样性越丰富，种质资源对生存环境的适应力越强，更容易扩展分布的范围和开拓新环境[10]。分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映，新的DNA标记技术如简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、表达序列标签(EST)扩增片段多态性(AFLP)、简单重复序列标记(ISSR)、单核苷酸多态性(SNP)等分子标记技术不断涌现应用，已成为现代作物育种领域的研究内容与技术手段。SSR标记与RAPD、RFLP等分子标记相比，SSR具有共显性、丰富的多态性、高度的稳定性，简便的操作性等优点[11]。为了更好地利用菜豆的种质资源，利用SSR分子标记对菜豆进行遗传多样性分析，得到相关数据从而判断其遗传关系，有助于菜豆优势基因的挖掘和种质材料的利用。目前SSR分子标记技术已被广泛应用于水稻[12]、小麦[13]、玉米[14]等大田作物。张赤红等[15]基于SSR标记技术对377份菜豆进行了遗传多样性评价并予以分类。试验拟利用分子标记技术对普通菜豆种质资源进行遗传多样性研究，探讨DNA水平上的遗传差异和遗传结构，分析普通菜豆种质资源的遗传多样性丰富程度，为保护菜豆种质资源保护和研究利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菜豆(见表1)：国家杂粮技术中心种质资源库。

1.2 普通菜豆基因组DNA提取和检测

普通菜豆种子在室温下种植，取生长至3周叶龄叶片采用CTAB法提取基因组DNA，利用核酸蛋白定量检测仪和1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的质量和浓度。浓度稀释至100 ng/μL，-20 ℃备用。

1.3 引物设计和筛选

32对试验引物参照文献[15-16]设计，以参试材料基因组DNA为模板进行PCR扩增，以条带清晰、多态性好、方便统计、稳定性好的SSR引物作为核心引物。

1.3.1 PCR扩增

(1) PCR反应体系：Taq酶(1.25 U) 0.1 μL，1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L)，1 μL模板DNA(100 ng/μL)，1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL 10×Taq Buffer，用超纯水将体积补齐至20 μL。

(2) PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，依据各引物退火温度复性30 s，延伸温度72 ℃延伸40 s，设置30个循环；最终72 ℃延伸7 min。

1.3.2 扩增产物检测 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，电泳结束后对凝胶结果进行快速银染检测。

(1) 灌胶：用8%的变性聚丙烯酰胺灌胶，防止出现气泡，轻轻插入梳子，使其聚合1.5 h左右。

(2) 电泳：清除气泡及残胶，插入样品梳子，接通电源，170 W恒功率电泳，预电泳10 min。每一个加样孔点入5 μL 样品。电泳2 h，电泳结束后小心分开两块玻璃板。

(3) 固定：50%无水乙醇+2%冰醋酸，轻轻晃动3 min。

(4) 漂洗：蒸馏水快速漂洗1次，不超过15 s。

(5) 显影：1.6% NaOH+0.4%甲醛显影，轻轻晃动至条带出现(胶背景为蛋黄色)。

1.4 数据记录和统计分析

采用手动读带法，统计清晰稳定、有差异的条带，有带记为1，无带记为0。用PopGene32v1.32软件计算各SSR引物的等位基因数、多态性信息含量值(PIC)、Shannon’s多样性指数。用NT-SYS计算品种间的相似系数，按类平均法(UPGMA)进行聚类分析，绘制品种间的亲缘关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性引物的筛选

利用69份普通菜豆种质资源材料对32对SSR引物进行多态性筛选，最终获得17对条带清晰、多态性好、方便统计、稳定性好的SSR引物用于对69份普通菜豆种质资源进行遗传多样性分析。引物BM170的PAGE电泳效果图如图1。

表1 69份供试材料

2.2 普通菜豆种质间的遗传多样性分析

利用PopGene32v1.32软件对69份普通菜豆种质资源进行遗传多样性分析见表2。经多态性分析结果显示：17对SSR标记共检测获得等位变异位点55个，变幅2～5个，平均每对检测到标记3.24个。其中标记BM143、BM141检测到的变异位点数最高为5个位点，标记BM183、DH2检测到的变异位点数最少为2个位点，其余标记皆检测到3～4个变异位点。17对引物的多态性位点数17个，多态性百分含量100%；17对SSR标记有效等位基因数(ne)介于1.417与3.805之间，平均2.347；观测等位基因数(na)介于2与5之间；Shannon(l)指数变异范围为0.566～1.360，平均0.912；基因流(Nm)介于0.030 与1.098之间，平均0.255。表明普通菜豆种质资源间变异范围较大，亲缘关系较远，具有丰富的遗传多样性。

2.3 69份普通菜豆种质资源的聚类分析

2.3.1 普通菜豆种质资源的GS聚类分析 GS聚类结果显示(图2) 69份菜豆种质材料间存在着不同程度的遗传差异性。材料间遗传相似性系数(GS)变异范围为0.392～0.963，平均值为0.659；其中编号5的秋豆角和编号60的农家品种Y96间遗产相似性系数最大为0.963，说明两份材料间亲缘关系最近；其次编号为11和28的材料CX50、红茬芸豆及编号为16和18的材料DQ01和白花芸豆间关系相对较近，遗传相似性系数为0.960，说明以上材料在菜豆杂交育种中应尽量避免作为亲本选配组合。其中编号4的垦芸3号和编号43的GHR1302间遗传相似性系数最小为0.392，说明这些材料间亲缘关系最远；其次编号8的黑芸豆Y120和编号45的红花脸间的遗传相似性系数为0.393，两者亲缘关系也相对较远；以上这些亲缘关系较远的材料可用作亲本选配杂交组合材料。以69份菜豆核心种质材料间的遗传相似性系数按UPGMA法进行聚类分析(图2)。SSR标记能很好地区分69份菜豆种质材料，在遗传相似系数0.60水平上将69份菜豆种子材料分为两个组群：第一组群包含编号为1、7、19等27份菜豆；在遗传相似系数0.67水平上分为I、II两个亚组群：第I亚组群包括编号为19、26、53的Y10Y14、花脸豆和脚印；第II亚组群包含编号为1的红腰饭豆等24份菜豆材料。第二组群包含编号为2、3、6等在内的42份材料；在遗传相似性系数0.67水平上又分为I、II两亚组群；第I亚组群包括编号43、52的GHR1302、蒙古圆两份材料；第II亚组群包含编号为40、68、64的翻眼芸豆、小红芸豆、白菜豆等40份菜豆材料，表明普通菜豆种质遗传多样性丰富。

从左至右依次为1～69号材料

Figure 1 DNA amplification results of 69 common kidney bean materials by primers BM170

表2 基于SSR标记的69份菜豆种质材料遗传多样性分析

图2 根据SSR构建的69份普通菜豆种质的聚类分析

2.3.2 SSR标记主坐标聚类分析 通过主坐标分析法对获取的69份材料SSR标记数据进行聚类分析，可将69份菜豆分为两大类，此分类同GS聚类中的聚类结果基本一致，见图3。

3 结论

试验利用筛选17对SSR标记引物对69份普通菜豆种质资源进行遗传多样性分析，经多态性分析结果显示：17对SSR的多态性位点数和平均等位变异位点分别为17.00，3.24个，多态性百分含量100%；有效等位基因数(ne)、观测等位基因数(na)和Shannon(l)指数的平均值分别为2.347，0.912，0.255，表明引物具有较高的多态性，可用于普通菜豆品种的区分；69份菜豆种质材料间遗传相似性系数(GS)变异范围为0.392～0.963，平均值为0.659，在遗传相似系数0.60水平上将69份菜豆种子材料分为两大组群，在遗传相似系数0.67处两个组群还共分为4个亚组群，表明普通菜豆种质遗传多样性丰富。后续将进行构建普通菜豆品种分子身份证，从而利用普通菜豆分子身份证构建和遗传多样性分析为优质亲本选配、品种鉴定和菜豆品质的监督与管理提供帮助。

图3 SSR主坐标分析聚类图