基于网络药理学的葛根治疗冠心病作用机制研究

李冰涛 章辉 肖思雨 翟兴英 涂珺 张启云 徐国良 邵峰 朱卫丰 刘荣华

摘要：目的  基于网络药理学方法探究葛根治疗冠心病的作用机制。方法  通过化学专业数据库收集葛根化学成分并对其进行类药性分析，预测作用靶点，构建成分-靶点网络;通过CooLGeN检索疾病相关基因，与葛根作用靶点做交叉分析，发现葛根治疗靶点，并进行蛋白质相互作用网络分析;最后进行GO生物学过程富集分析、通路富集分析。结果  葛根的成分-靶点网络包含70个成分、180个相应靶点，其中18个靶点为葛根治疗冠心病的靶点。主要生物过程包括氮和氧的代谢与合成及脂肪酸代谢，主要通路包括血小板活化通路、花生四烯酸代谢通路、AGE/RAGE通路、一氧化氮作用通路等。结论  葛根通过多靶点、多通路发挥对冠心病的治疗作用，一氧化氮作用通路、AGE/RGAE通路、花生四烯酸通路等可能是葛根治疗冠心病的主要通路。

关键词：葛根;冠心病;网络药理学;生物过程;通路分析

中图分类号：R259.414;R285    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0096-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.021      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To study the molecular mechanism of coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix based on network pharmacology. Methods Chemical components of Puerariae Lobatae Radix were collected through chemical professional database and the drug-like properties were analyzed; the targets were predicted; a component-target network was constructed. Disease-related genes were retrieved by CooLGeN and were cross-analyzed with the targets of Puerariae Lobatae Radix; the therapeutic targets of Puerariae Lobatae Radix were found; protein interaction network analysis was performed. Finally， the enrichment analysis of GO biological process and pathway enrichment analysis were carried out. Results Component-target network of Puerariae Lobatae Radix contained 70 components and 180 corresponding targets， of which 18 targets were targets for the treatment of coronary heart disease. The main biological processes included the metabolism and synthesis of nitrogen and oxygen and fatty acid metabolism. The main pathways included platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， AGE/RAGE pathway， and nitric oxide pathway. Conclusion The therapeutic effect of Puerariae Lobatae Radix on coronary disease may be realized through a multi-targets and multi-pathways way， and platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， and AGE/RAGE pathway may play an important role in coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix.

Keywords： Puerariae Lobatae Radix; coronary disease; network pharmacology; biology process; pathway analysis

冠心病是冠状動脉粥样硬化所致的管腔狭窄，冠状动脉供血相对不足，引起心肌缺血、缺氧的心脏疾病[1]，属中医学“胸痹”“心悸”范畴。《金匮要略》认为胸痹的病机为“阳微阴弦”。心气不足，痰瘀互结，心气虚无力推动血液在脉道中运行，则血行瘀滞而瘀阻心脉[2]。葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，性凉，味甘、辛，归脾、胃、肺经[3]。《神农本草经》记载葛根“主诸痹”，即可用于气血痹阻不通之证。由于葛根成分复杂，且冠心病的发生发展涉及机体调控网络中多个基因和信号通路，单靶点、单药物的研究方法不适合系统说明葛根治疗冠心病的机制。因此，本研究基于网络药理学，通过对葛根药物-靶点-生物过程-途径的复杂网络关系研究，从多成分、多通路作用角度阐述葛根治疗冠心病的作用机制。

1  资料与方法

1.1  化学成分收集

基于化学专业数据库（http：//www.organchem. csdb.cn）收集野葛化学成分，检索日期为2018年8月1日。除去金属元素与结构正在更新的化学成分，通过PubMed Compound（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed）与Chemicalbook数据库（https：//www. chemicalbook.com/）确认分子结构，下载并保存为sdf或mol格式文件，建立葛根成分数据库。

1.2  类药性分析

化学成分通过吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程才能发挥药效。药物的吸收是药物成药的基础，类药性分析是评价吸收特性的基础分析方法。根据Lipinski规则，当氢键供体数目（连接在N和O上的氢原子数）>5、氢键受体数目（N和O的数目）>10、相对分子质量>500、脂水分配系数ClogP>5或MlogP>4.15、化合物中可旋转键的数量超过10个时，吸收或渗透效果较差的可能性更大[4]。利用SYBYL2.0软件设计分子表单，计算相应参数，以违背该规则2项以上为排除标准，从葛根成分数据库中筛选活性成分。

1.3  药物靶点预测

1.3.1  葛根成分-靶点网络

基于Swiss target prediction数据库（http：//www. swisstargetprediction.ch/），依据分子SMILES号查找相应靶点，将其下载为csv格式并整理。为提高预测靶点的质量，本研究以与葛根小分子交互作用概率>50%（Probability>0.5）的靶点作为有效靶点。利用Cytoscape3.2.1软件建立可视化成分-靶点网络。在该网络中，各化合物与对应的靶点进行关联，节点代表蛋白或化合物，线代表蛋白与化合物的相关性[5]。

1.3.2  药物-疾病共同靶点分析

CooLGeN是在线文本挖掘工具，通过关键词检索检索可以发现关键词相关的基因。本研究基于CooLGeN（http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php）收集疾病靶点，通过与葛根作用靶点交叉分析，得到葛根治疗冠心病的可能作用靶点。为保证检索疾病靶点的有效性，避免假阳性，研究过程中依据文献影响因子和靶点基因频率删除部分文献影响因子低且支持数据较少的靶点基因。具体方法为：以冠心病的医学主题词“Coronary disease”为检索词，文献影响因子（impact factor）为5～40，出版年限（publishing year）为1988～2018，靶点基因类型（input genes）为All human genes，基于文献检索冠心病的相关靶点基因，筛选基因频率最高的80%基因为疾病基因。最后将葛根成分靶点与冠心病靶点导入Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行分析。

1.3.3  蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

药物对疾病的治疗效应是多个蛋白交互作用的结果。本研究使用在线交互作用工具GeneMANIA（http：//genemania.org/）构建葛根治疗冠心病的交互作用网络。首先将葛根治疗冠心病的可能作用蛋白转化为基因名，导入GeneMANIA，物种选择为人（Homo sapions），构建蛋白质交互作用关系，然后将蛋白质交互关系以csv格式文件导入Cytoscape3.2.1，可视化蛋白质交互作用网络，分析网络节点特征（Degree）找出葛根治疗冠心病的重要靶点。

1.3.4  生物学过程与通路富集分析

将葛根治疗冠心病交互作用蛋白导入ClueGO插件，分别进行生物学过程（biology process）富集分析和通路（pathway）富集分析。通路富集分析数据库选择KEGG和wikipathway数据库，P≥0.05，其余参数均为默认值。

2  结果

2.1  葛根化学成分及类药性分析

通过对下载成分结构进行确认，共得到葛根成分100个，主要为黄酮类成分。其中94个成分符合Linpinski类药性原则，编号为M1～M94，见表1。

2.2  葛根成分-靶点作用网络构建

葛根94个成分中，24个成分无有效靶点，其余70个成分共作用于180个靶点，依据其对应关系构建成分-靶点网络（见图1）。可见，1种成分可作用于多个靶点，1个靶点也联系着多种成分，体现了葛根多靶点、多通路的作用特点。

2.3  葛根治疗冠心病的作用靶点分析

基于CooLGeN检索得到冠心病相关基因508个。对冠心病相关基因及葛根作用靶点基因名称进行交叉分析，比对冠心病及葛根共同基因18个，分别为NOS3、NOS1、NOS2、ALPP、MPO、CDK1、MMP2、MMP3、ESR1、CYP19A1、FABP4、PTGS1、PTGS2、ALDH2、LDLR、MIF、TERT、CYP1A1。这些基因可能是葛根治疗冠心病的作用靶点。

2.4  靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

将葛根治疗冠心病的18个可能作用靶点以基因名称导入GenMANIA，发现20个蛋白与葛根治疗冠心病的靶点有交互作用，基于葛根作用靶点及交互作用的38个蛋白构建的蛋白质交互作用网络见图2。可以看出，在葛根治疗冠心病蛋白质交互作用网络中，Degree值较高的前5个节点依次为CYP119A1（31）、NOS1（29）、CYP11A1（26）、NOS3（25）、NOS2（24），这些节点蛋白可能在葛根治疗冠心病作用的过程中发挥重要作用。

2.5  生物学过程富集分析

对蛋白质交互作用网络中的38个基因进行生物学过程富集分析，共获得89条生物过程。以P<0.01为条件，前20条生物通路的注释信息见表2。结果显示，葛根治疗冠心病的生物学过程主要为cGMP生物合成过程的正向调控、活性氧代谢过程、cGMP代谢过程的正向调节、cGMP生物合成过程、cGMP生物合成过程的调控、cGMP代谢过程、一氧化氮代谢过程、活性氮代谢过程、活性氧生物合成过程、一氧化氮生物合成过程、甾醇代谢过程、核苷酸代谢过程的正向调节、嘌呤核苷酸代谢过程的正向调节、长链脂肪酸代谢过程等。

2.6  通路富集分析

对葛根治疗冠心病交作用靶点进行通路富集分析，共获得32条通路，其中18条通路来源于KEGG数据库，14条通路来源于Wiki Pathways数据库，见图3。这些通路包括花生四烯酸代谢通路、血小板活化通路、一氧化氮作用通路、AGE/RAGE通路、精氨酸生物合成通路、精氨酸与脯氨酸代谢通路、NF-κB信号通路、脂肪酸ω氧化通路、醛固酮合成与分泌通路、脂肪细胞脂解作用调节通路、前列腺素的合成与调控通路、雌激素受体通路、硫胺素代谢通路、叶酸生物合成通路、肾素分泌通路、唾液分泌通路、甾体激素生物合成通路、色氨酸代谢通路、细胞色素P450对外源化合物代谢影响、卵巢类固醇生成通路、维生素B12代谢通路、叶酸代谢通路、细胞色素P450氧化通路等。

3  讨论

网络药理学是从整体角度认识药物与机体的相互作用，这种现代生物医药研究的哲学理念和研究模式与中医整体观念不谋而合，为中医药现代化研究提供了新的思路。探索中药治疗疾病的作用机制是网络药理学在中医药研究中的主要应用领域。

本研究运用网络药理学方法探索葛根治疗冠心病的机制。通过葛根治疗冠心病的物质基础，构建其治疗冠心病的蛋白质相互作用网络，并富集了该生物学过程和代谢通路。结果显示，葛根治疗冠心病可能与cGMP、一氧化氮的生物合成、代谢，活性氧的生成，花生四烯酸代谢及脂肪酸氧化等相关，这些生物过程与葛根扩张血管、降脂、抗炎、抗氧化等药理作用一致。代谢通路中氨基酸、激素、酯类代谢和一氧化氮的作用通路等都与冠心病有关。精氨酸与脯氨酸代谢通路在冠心病心血瘀阻证的亚血瘀证期发挥了重要作用[6]。花生四烯酸代谢也与冠心病密切相关，血栓素A2和前列环素作为花生四烯酸代谢产物，二者之间的平衡失调会导致冠心病进一步发展，甚至发生心肌梗死[7]。另外，AGE/RAGE通路与冠心病的发生也有着一定的关系，晚期糖基化终末产物（AGEs）在动脉管壁中巨噬细胞和平滑肌细胞内外的沉积，与动脉粥样硬化病变严重程度有关。AGEs与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合会激活核因子-κB，分泌大量致炎性因子，造成血管内皮损伤，加速动脉粥样硬化斑块发展，体外实验显示葛根提取物能抑制AGEs形成[8-9]，AGE/RAGE通路可能是个葛根治疗冠心病的重要通路。一氧化氮是一种信使分子，可舒张血管周围的平滑肌细胞，使血管扩张，增加心肌供血供氧，改善冠心病患者心肌缺血缺氧状态。临床研究显示，葛根主要成分葛根素能显著升高冠心病患者一氧化氮水平，有效改善心肌缺血[10]。血栓形成学说是冠心病的主要发病學说，活化的血小板暴露的磷脂内膜可以促进凝血过程发生和发展。葛根治疗冠心病与其血小板活化作用相关[11]。

本研究采用网络药理学方法初步研究葛根治疗冠心病机制，研究结果显示富集分析获取的生物过程与药理效应相符，相关代谢通路可能是葛根治疗冠心病的机制。本研究结果可为后期实验研究提供理论依据与参考。

参考文献：

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（收稿日期：2018-10-18）

（修回日期：2018-11-22;编辑：陈静）