芍药苷对脑缺血再灌注损伤大鼠NLRP3炎症体信号通路相关因子表达的影响

刘湘 乔丽菲 刘垚君 郑范丽 张玉琴 林羽

摘要：目的  觀察芍药苷对脑缺血再灌注损伤大鼠NLRP3炎症体信号通路相关因子表达的影响，探讨其神经保护作用机制。方法  SPF级雄性SD大鼠48只，随机分为假手术组、模型组、芍药苷低剂量组、芍药苷高剂量组，每组12只。采用线栓阻断法制作大鼠脑缺血再灌注模型，缺血2 h后进行再灌注，再灌注后1 h腹腔注射芍药苷（2.5、5 mg/kg），每日1次，连续7 d。Zea Longa 5分评价方法对大鼠进行神经功能评分。ELISA检测大鼠血清白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α的含量。RT-PCR和Western blot分别检测大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白的表达。结果  与模型组比较，芍药苷低、高剂量组大鼠神经功能评分各时点均降低，芍药苷低剂量组第7日和芍药苷高剂量组第3、5、7日神经功能评分差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表达均上调;与模型组比较，芍药苷低、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.01）。结论  芍药苷对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用，其机制可能与抑制NLRP3炎症体信号通路分子的表达、减轻炎症反应相关。

关键词：脑缺血再灌注损伤;芍药苷;NLRP3;NLRP1;Caspase-1;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.010      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of paeoniflorin on cerebral ischemic-reperfusion injury through NLRP3 inflammatory signaling pathway; To explore its neuroprotective mechanism. Methods Totally 48 SPF male SD rats were randomly divided into four groups with 12 rats in each group： sham-operation group， cerebral ischemic-reperfusion group， paeoniflorin high- and low-dosage groups. Suture-occluded method was used to block middle cerebral artery and I/R model of SD rats was made. Paeoniflorin 2.5， 5 mg/kg （one time per day and for seven days） were administrated by intraperitoneal injection after 2 h ischemic and 1 h reperfusion. Zea Longa 5-point evaluation method was used for neurological impairment score in rats. Contents of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α were detected by ELISA. Western blot and RT-PCR were used to detect the protein and gene expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α， as well as Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 in brain tissue. Results Compared with the model group， the neurological scores of paeoniflorin high- and low-dosage groups decreased at different time points; there were statistical significance in the neurological scores on the 7th day of paeoniflorin low-dosage groups and the 3rd， 5th and 7th day of paeoniflorin high-dosage groups （P<0.05， P<0.01）. Compared with sham-operation group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in the model group increased， and the expressions of IL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 mRNA and protein were up-regulated in rat brain in the model group; compared with the model group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in paeoniflorin high- and low-dosage groups significantly decreased， and IIL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1， NLRP3 mRNA and protein expression in brain tissue were significantly down-regulated （P<0.01）. Conclusion Paeoniflorin has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to inhibition of molecule expression of NLRP3 inflammatory signaling pathway， thereby reducing inflammation.

Keywords： cerebral ischemia-reperfusion injury; paeoniflorin; NLRP3; NLRP1; Caspase-1; rats

脑卒中具有发病率、病死率、致残率和复发率高的特点，随着人口步入老龄化社会，其发病率呈逐年上升趋势。其中缺血性脑卒中约占脑卒中发病的80%，是一个涉及多种机制、多个阶段、多种细胞各自及相互作用的过程[1]。芍药苷是白芍中主要活性成分之一，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗肝纤维化[4]、抗动脉粥样硬化[5]及抗肿瘤[6]等药理作用。近年来，芍药苷在脑损伤方面的作用受到越来越多的关注。课题组前期研究发现，芍药苷可通过抑制神经元凋亡、调控Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路，发挥对脑缺血再灌注（ischemic-reperfusion，I/R）损伤的保护作用[7-8]。本研究建立脑I/R损伤大鼠模型，观察芍药苷对I/R损伤大鼠NLRP3炎症体信号通路相关因子表达的影响，探讨其神经保护作用机制，为临床寻找治疗新靶点提供依据。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量（260±20）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号SCXX（沪）2017-0005，动物质量合格证号2015000547928。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级医学实验动物房。

1.2  药物

芍药苷，中国食品药品检定研究院提供，批号110736-201033。

1.3  主要试剂与仪器

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher，K1622），Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo Fisher，4367659），Caspase-1多克隆抗体（Abcam，ab1872），NLRP1多克隆抗体（Abcam，ab3683）;NLRP3多克隆抗体（Novusbio，NBP2-12446），β-actin抗体（Cell Signaling Technology，#4970），SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），HRP结合山羊抗兔 IgG、HRP结合兔抗鼠 IgG（厦门鹭隆生物科技有限公司）。实时荧光定量PCR仪（AppLied Biosystems，型号7900HT），凝胶成像分析系统（Bio-Rad，型号ChemiDoc XRS+），高速台式冷冻离心机（ThermoFisher，型号PrimoR），线栓（广州佳灵生物技术有限公司，型号3600）。

2  实验方法

2.1  造模

将实验大鼠随机分为假手术组（12只）和造模组（36只），术前12 h禁食不禁水，次日根据前期造模方法[7-8]进行左侧大脑中动脉阻塞手术。造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA），并结扎，分离颈内动脉（ICA），将线栓经CCA插入ICA至颅内大脑前动脉的近端（18～20 mm），停止插线以阻断该侧大脑中动脉血流，导致脑缺血，阻塞2 h后拔出线栓实现再灌注。假手术组除不插入线栓外其余操作同造模组。

2.2  大鼠神经功能评分

术后24 h根据Zea Longa 5分评价方法[8]对脑I/R损伤大鼠进行神经功能损伤评价，将大鼠神经症状分为0～4分。0分：无神经功能缺损;1分：提尾时右前肢内收，不能完全伸展;2分：自发行走时向右侧转圈;3分：行走时身体向右侧倾倒;4分：不能自发行走，有意识丧失。选择评分为1～3分造模成功大鼠进行后续实验。

2.3  分组和给药

将造模组大鼠分为模型组、芍药苷低剂量组和芍药苷高剂量组，每组12只。再灌注后1 h，芍药苷低、高剂量组大鼠分别腹腔注射芍药苷2.5、5 mg/（kg·d），假手术组和模型组大鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。给药体积0.6 mL/100 g，每日1次，连续7 d。

2.4  ELISA检测血清相关炎症因子含量

末次给药后，大鼠麻醉腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，收集上清液，根据ELISA试剂盒说明书步骤进行IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量检测。

2.5  RT-PCR检测脑组织相关炎症因子mRNA表达

末次给药后，大鼠麻醉取左侧脑组织100 mg。Trizol法提取总RNA，检测A260、A280，取A260/A280在1.8～2.0的样品，计算总RNA浓度。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录，各目的基因扩增引物序列见表1。实时定量PCR反应：50 ℃预热2 min，95 ℃预热10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。采用ABI7900荧光定量PCR仪上软件进行数据分析，计算目的基因相对表达量。

2.6  Western blot检测大鼠脑组织Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表达

末次给药后，大鼠麻醉取左侧脑组织100 mg，加入含1%PMSF裂解液1 mL，研磨，12 000×g离心10 min，取上清液，采用BCA法测样品蛋白浓度，并计算30 μg样品蛋白的体积。加入1/4体积5×蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃变性7 min。常规12%SDS-PAGE分离，转膜，封闭2 h，加入稀释的一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜，次日TBST洗3次×10 min，加入1∶5000稀释HRP标记的二抗，室温孵育2 h，TBST洗3次×10 min。加ECL顯色剂，经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对表达量，并分析组间差异。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间差异用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  芍药苷对模型大鼠神经功能损伤的影响

模型组大鼠术后3 d神经功能损伤情况逐渐加重，神经功能评分较假手术组显著升高（P<0.01）;与模型组比较，芍药苷低剂量组第1、3、5日和芍药苷高剂量组第1日大鼠神经功能评分差异无统计学意义，芍药苷低剂量组第7日和芍药苷高剂量组第3、5、7日大鼠神经功能评分显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见图1。

4.2  芍药苷对模型大鼠血清炎症因子含量的影响

与假手術组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，芍药苷低、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见图2。

4.3  芍药苷对模型大鼠脑组织相关因子mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药苷低、高剂量组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表达均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图3。

4.4  芍药苷对模型大鼠脑组织相关因子蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，芍药苷低、高剂量组大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表达均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图4、图5。

5  讨论

近年研究显示，神经元和胶质细胞内NLRP1和NLRP3炎症小体可能在缺血性脑中风的细胞损伤方面和炎症反应调节中扮演着重要角色[9-11]。I/R损伤涉及多种因素相互作用的炎症级联反应过程，在此过程中，NLRP3炎症小体被激活，随后释放Caspase-1、IL-1β等炎性物质，持续作用于损伤组织，加重组织的损伤[9]。所以，抑制或阻断NLRP3炎性体的激活可能为I/R损伤所引起的炎症提供新的治疗策略。在缺血性脑中风发生后，NLRP3或NLRP1蛋白与Caspase-1前体和ASC等结合形成多蛋白复合物NLRP3或NLRP1炎症小体，炎症小体形成后，Caspase-1前体通过自身催化作用被激活，激活后的Caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前体，使之形成具有活性的成熟形式并随即释放进胞外环境与细胞膜上相应受体结合，介导下游MAPK和核因子-κB通路，从而诱导神经元增殖、凋亡[12-13]。

本研究结果表明，低剂量芍药苷可显著降低大鼠第7日神经评分，高剂量芍药苷可显著降低大鼠第3、5、7日神经评分，改善神经功能损伤，验证了芍药苷对脑I/R损伤大鼠的保护作用。此外，本研究还发现，芍药苷可明显降低大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的含量。被激活后的NLRP3炎性体可促进Caspase-1表达，并进一步导致IL-1β、IL-6、TNF-α等与炎症级联反应有关的细胞因子的活化[14]。

综上所述，芍药苷能有效抑制脑I/R损伤后缺血脑组织Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表达，并能降低NLRP3炎症体信号通路下游的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，提示芍药苷可抑制NLRP3信号通路的激活，从而减轻脑I/R损伤。

参考文献：

[1] GO A S， MOZAFFARIAN D， ROGER V L， et al. Heart disease and stroke statistics - 2014 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2014，129：399-410.

[2] ZHU S H， LIU B Q， HAO M J， et al. Paeoniflorin suppressed high glucose-induced retinal microglia MMP-9 expression and inflammatory response via inhibition of TLR4/NF-κB pathway through upregulation of SOCS3 in diabetic retinopathy[J]. Inflammation，2017，40（5）：1475-1486.

[3] 郭春燕，罗强，孙黎，等.芍药苷对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用[J].中草药，2013，44（20）：2864-2871.

[4] HU Z， QIN F， GAO S， et al. Paeoniflorin exerts protective effect on radiation-induced hepatic fibrosis in rats via TGF-β1/Smads signaling pathway[J]. American Journal of Translational Research，2018，10（3）：1012-1021.

[5] LI H， JIAO Y， XIE M. Paeoniflorin  ameliorates atherosclerosis by suppressing TLR4-mediated NF-κB activation[J]. Inflammation， 2017，40（6）：2042-2051.