miR-222对肺癌细胞的生物学特性影响

周 敏 郭建峰

当前肺癌位于恶性肿瘤全球发病率和死亡率第一位，不过生长分裂较慢，扩散转移比较晚，患者早期没有特征性临床症状[1-2]。手术为肺癌的主要根治方法，但是很多患者在确诊时失去了手术治疗指征。现代研究显示肺癌的发生、发展和侵袭转移是1个涉及多因素、多过程、多步骤的复杂漫长过程，抑癌基因的缺失或表达失调是肺癌发生与发展的主要原因之一[3-4]。MicroRNAs(miRNAs)是1类进化高度保守、内源性的小分子编码RNA，可参与调控细胞增殖、分化、凋亡、迁移等多种生物学事件[5-6]。miRNAs与肺癌的发生与发展有显著相关性，当前研究显示miR-222异常表达与肺癌的恶性转化、临床预后、细胞信号转导、增殖、浸润转移等有一定关系，其作用机制尚未完全清楚[7-8]。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，人mTOR基因编码由2549个氨基酸组成的蛋白质，在细胞的增殖与凋亡过程中起着中心调控点的作用，也是肿瘤发生、发展的重要原因之一[9-11]。本文具体探讨了miR-222对肺癌细胞的生物学特性影响及其机制。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

研究时间为2017年2月到2018年1月，人肺癌A549细胞系购买于中国科学院上海细胞库，保存在本实验室；miR-222 mimics、miR NC、miR-222 inhibitor购自上海吉玛公司；羊抗鼠PTEN、Akt、mTOR抗体与GAPDH内参抗体购自Santa Cruz 公司；QuickShuttle转染试剂购自Sigma公司；Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自上海生工公司。DMEM细胞培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；HRP抗兔二抗购自英国Abcam公司。

1.2 细胞转染

取对数生长期A549细胞胰酶消化后，以1×106细胞密度接种于6孔培养板中，培养过夜后进行转染。适量miR-222 mimics(实验组)、miR NC(对照组)、miR-222 inhibitor(抑制组)转移至离心管中，使得终浓度为50 nM。将miRNAs与转染试剂混合液加入培养细胞中，转染完成后采用DMEM培养基继续培养。转染后48 h提取各组细胞的总RNA，采用qRT-PCR方法检测miR-222表达情况。

1.3 MTT法检测细胞增殖

转染后24 h、48 h，各组细胞孔中加入20 μl 0.5 mg/ml MTT溶液继续培养，6 h后终止培养，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min后使用酶标仪540 nm波长处检测细胞光密度，检测与计算增殖活性。

1.4 双染法检测细胞凋亡

转染后24 h、48 h，各组细胞采用无菌PBS洗涤2遍，用250 μl结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为5×105/ml左右，取200 μl的细胞悬液加入10 μl的Annexin-FITC，再加入10 μl浓度20 μg/ml的PI锭，室温避光孵育10 min，加入500 μl PBS进行重悬，在上流式细胞仪读数与记录细胞凋亡指数。

1.5 Western-blot检测细胞蛋白表达

转染后48 h后在各组细胞中加入400 μl的RIPA裂解液，用枪头反复吹打均匀，室温放置10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清测定蛋白浓度后。取20 μg蛋白跑SDS-PAGE胶，采用Western-blot检测细胞蛋白表达情况，一抗(1∶1 000)、4 ℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)37 ℃放置30 min，采用Odyssey荧光检测仪检测目的条带，使用GAPDH作为内参。

上述实验都重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法

应用SPSS 23.00软件进行分析，结果中的计量数据按照均数±标准差(Mean±SD)来表示，两组与多组间比较采用t检验、单因素方差分析(one-wayANOVA)，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 miR-222表达对比

转染48 h后，实验组中miR-222表达水平显著上调，抑制组显著降低，与对照组对比差异都有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组转染后48 h的miR-222相对表达量对比

注：与对照组对比，*为P<0.05；与抑制组对比，#为P<0.05。

2.2 细胞增殖活性对比

转染24 h、48 h后，实验组的细胞增殖活性显著高于抑制组与对照组(P<0.05)，抑制组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组转染后不同时间点的细胞增殖活性对比

注：与对照组对比，*为P<0.05；与抑制组对比，#为P<0.05。

2.3 细胞凋亡率对比

转染24 h、48 h后，实验组的细胞凋亡率显著低于抑制组与对照组(P<0.05)，抑制组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 三组转染后不同时间点的细胞凋亡率对比

注：与对照组对比，*为P<0.05；与抑制组对比，#为P<0.05。

2.4 PI3K/AKT/mTOR蛋白表达对比

转染48 h后，实验组的m-TOR蛋白表达水平显著高于抑制组与对照组(P<0.05)，三组PI3K、AKT蛋白表达水平对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 三组转染后48h的PI3K/AKT/mTOR蛋白表达对比

注：与对照组对比，*为P<0.05；与抑制组对比，#为P<0.05。

3 讨论

当前肺癌对人们健康的威胁日益严重，虽然当前治疗方法与药物不断推陈出新，但患者的5年生存率并没有显著提高[12]。因此寻找影响肺癌发生与发展的分子标志物，对早期诊治肺癌具有重要的价值。miRNAs是1类长约22nts的单链RNA，属内源性非编码小RNA，人体基因组中超过1/3的蛋白编码基因可能受miRNAs调控，各种因素所导致的miRNAs表达异常，都可造成机体产生疾病[13-14]。

miR-375 mimic的导入能够模拟细胞内的内源性miR-222，建立miRNA过表达的模型；而miRNA inhibitor是可以与miR-222完全互补的反义寡核苷酸序列，转染后可抑制miRNA的功能[15]。本研究转染后检测显示发现mimic组miR-22的表达水平显著高于对照组，抑制组miR-222的表达水平显著低于对照组，表明本研究成功地建立了miR-22过表达及体系抑制表达的瞬时表达。当前研究表明miR-222可参与多种肿瘤的形成和发展，在头颈部、胰腺癌、肝癌、胃癌肿瘤中呈高表达状况[16-17]。本研究显示转染48 h后，实验组中miR-222表达水平显著上调，抑制组显著降低，与对照组对比差异都有统计学意义(P<0.05)。转染24 h、48 h后，实验组的细胞增殖活性显著高于抑制组与对照组(P<0.05)，抑制组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)，表明miR-222的过表达能促进肺癌细胞的增殖。最近研究显示miR-222的过表达使肺癌细胞A549侵袭转移能力增强，促使基底膜降解增多，破损处增多，利于肿瘤细胞从原发灶脱离、迁移，促进细胞增殖[18-19]。

miRNAs介导的转录后调控是1种重要的表观遗传学手段，于人体内miRNAs已超过千种，调控了人体内60%的功能基因的表达，并在细胞增殖、凋亡等多个生理过程中发挥着重要作用，其可通过间接或直接的方式参与疾病的病理进程[20]。细胞凋亡情况是反应细胞损伤程度的重要指标，本研究显示转染24 h、48 h后，实验组的细胞凋亡率显著低于抑制组与对照组(P<0.05)，抑制组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05)。当前也有研究显示miR-222具有抑制细胞凋亡的作用，它可通过激活AKT通路促进活性氧的释放，最终抑制凋亡的发生[21-22]。

某一特定miRNA可同时作用多个靶基因，而同1个基因又可受到多个miRNA转录后调控[23]。有研究显示PI3K是miR-222的靶基因，它可通过下调PIK3受体表达抑制下游信号而发挥调节作用[24]。本研究显示转染48 h后，实验组的m-TOR蛋白表达水平显著高于抑制组与对照组(P<0.05)，三组PI3K、AKT蛋白表达水平对比差异无统计学意义(P>0.05)。由此推测miR-222可通过间接影响P13K/AKT/mTOR信号传导实现对肺癌的调控作用。当前也有研究表明miR-222的高表达可使PI3K激酶活性相对增强，激活PI3K/AKT/mTOR信号途径，利于肿瘤细胞的增殖[25]。

综上所述，miR-222基因过表达可通过激活Akt-mTOR信号通路，降低肺癌细胞凋亡指数，提高细胞增殖活性，从而发挥促癌作用。