酱油胀罐的原因分析及解决方案的探讨
2019-11-15高晓娟刘凤红王君高
高晓娟，刘凤红，王君高
(1.齐鲁理工学院，济南 250200；2.齐鲁工业大学，济南 250200)
潍坊一酱油生产厂商生产的某批次部分酱油出现胀罐问题，酱油在贮存过程中出现产气胀罐的现象，不但破坏了产品外观，也降低了产品质量，包括营养成分的破坏、pH值的改变等，给生产企业带来了巨大的经济损失，同时，胀罐爆裂还可能危及人身安全[1]。因此，研究酱油胀罐问题势在必行。
该研究欲从微生物角度分析胀罐问题产生的原因，分析产气微生物的种类，并通过添加防腐剂或改变灭菌温度实现胀罐问题的解决[2,3]。另外，研究胀罐酱油的原因不仅可以预防和解决酱油胀罐问题，同时对普遍存在于食品行业中的胀罐现象提供了一定的指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
胀罐酱油：取自山东某酿造厂；达标酱油：取自胀罐酱油酿造厂及实验室自制酱油；酒精：实验室自制93% vol食用酒精；AgNO3、铬酸钾、NaCl、NaOH、苯甲酸钠：均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂：均为生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海市海宏实验设备有限公司；恒温水浴锅 余姚市亚星仪器仪表有限公司；GMSX-280灭菌锅 北京市永光明医疗仪器厂；XS-212-201光学显微镜 南京江南永新光学有限公司；MP1002电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；超净工作台 江苏净化设备有限公司。
1.3 实验分析方法
1.3.1 酸度的测定
根据酸碱中和原理，用NaOH标准溶液滴定试样中的总酸，以pH 8.2为电位滴定终点，根据消耗NaOH标准溶液的体积计算出试样中总酸的含量。
1.3.2 酱油盐含量(以氯化钠计)的测定[4]
该方法是以铬酸钾为指示剂，用AgNO3滴定样品中的NaCl。此法是利用AgNO3与NaCl反应产生乳白色沉淀，当溶液中存在游离的Ag+时，铬酸钾与其发生显色反应，变为橘红色即为滴定终点。根据消耗的AgNO3标准溶液的体积计算出试样中的盐含量。
1.4 微生物的筛选方法
1.4.1 培养基的选择
酱油培养基：取达标酱油250 mL于500 mL三角瓶中，琼脂4.5 g于250 mL三角瓶中并加入水50 mL，121 ℃灭菌20 min。冷却到50 ℃左右，在超净工作台上，将琼脂倒入灭菌后的酱油中混匀即可。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。
马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。
在无菌条件下，取胀罐酱油和达标酱油各200 μL于3种培养基平板上，涂布均匀后，于30 ℃恒温培养3 d，观察微生物的生长情况。
1.4.2 革兰氏染色法[5]
制片(涂菌→干燥→固定)→染色(初染→媒染→脱色→复染)→干燥→镜检(革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色)。
1.5 防腐剂的添加对酱油的影响实验
实验使用的防腐剂为苯甲酸钠和酒精[6]。采用酒精作为防腐剂之一，原因有以下几点：一是酱油本身含有一定量的酒精，酒精的存在对酱油香气的产生有一定作用；二是酒精具有一定的杀菌作用，在食品中加入酒精会有一定抑菌效果；三是现在的防腐剂开发主要向着天然提取物发展，酒精作为防腐剂具有安全性。此外，将酒精添加到一些调味品中，可以增加调味品的作用，如酒精可以去腥味。
1.5.1 酒精对微生物抑制情况的研究
取实验室自制酱油1600 mL分装到8个250 mL三角瓶中，每个三角瓶装200 mL，80 ℃灭菌30 min，冷却后按表1加入苯甲酸钠和酒精。混匀封口，室温保存。
表1 防腐剂的添加量
将上述酱油放置40 d后，分别取1 mL于平板上，倒入冷却到40 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基中，待培养基冷却后，将其放入恒温培养箱中，30 ℃倒置培养1 d，取出，记录菌落数[7]。
1.5.2 防腐剂对胀气微生物的抑制情况
取实验室自制酱油5000 mL，80 ℃灭菌30 min，分装到9个550 mL塑料瓶中，每瓶500 mL。每瓶中加入胀罐酱油10 mL，按表2加入防腐剂。混匀后，用实验室自制酱油将瓶补满。用排空气体的气球封口，室温保存，观察产气情况。
表2 防腐剂的种类及添加量
1.6 灭菌温度对酱油的影响实验
取胀罐酱油300 mL分装到3个250 mL三角瓶中，分别在70，80，90 ℃灭菌20 min，冷却后装入细口的塑料瓶(250 mL)中，再添加实验室酱油100 mL，混匀后，用排空空气的气球封口，室温保存，观察产气情况。
2 实验结果与分析
2.1 酱油成分分析
本实验对该厂的胀罐酱油和达标酱油的酸度、含盐量(以氯化钠计)进行了测定，两者进行对比，结果见表3。
表3 达标酱油与胀罐酱油化学成分分析结果
由表3可知，达标酱油与胀罐酱油的酸度无明显的差异，总酸均低于国家标准，可以认为引起胀罐发生的微生物不产酸；食盐是杀死和抑制微生物生长的防腐剂，也是各种酶活力的抑制剂，不同食盐含量对各种微生物有着不同的抑制作用。国家标准(GB-3-77)规定，酱油卫生标准要求食盐含量不低于15 g/dL(以氯化钠计)。通过实验证明，样品中的食盐含量亦在国标控制范围内，初步排除是常引起酱油胀罐的耐盐性产膜酵母污染的可能性[8]。
2.2 产气微生物的筛选分析[9-12]
2.2.1 在酱油培养基上
无任何微生物生长，培养时间不断延长，也没有微生物的生长。
2.2.2 在马铃薯培养基上
培养3 d后，有菌落生成，且菌落形态各异，证明生长的微生物种类较多。分别取2种典型菌落进行实验分析，经镜检观察到，一种微生物大小与啤酒酵母相近，呈球状，耐高盐，但生长缓慢，经鉴定该菌不产气；另一种微生物经革兰氏染色为革兰氏阳性菌，有芽孢，经产气实验鉴定有气体产生，但生长缓慢，原因可能是该菌的耐盐性不高，但是可以在酱油内以芽孢的形式存活。
2.2.3 在牛肉膏蛋白胨培养基上
菌落呈乳白色，边缘不均匀，菌落无光泽。该菌呈球状，为革兰氏阴性菌，不产芽孢，且无气体产生。
上述实验表明，在胀罐酱油中不仅含有产气的微生物，同时含有不产气的微生物。具体是何种微生物，需要后续的大量科研工作。
2.3 防腐剂对胀罐问题的影响
2.3.1 酒精的抑菌效果
实验结果表明，加入1%酒精的样品酱油在室温保存2个月后，外观无特殊现象；而未添加酒精的样品酱油表层形成明显的菌醭，在容器表面上有一些白色斑点形成，从外观形态分析应为霉菌类微生物，由此可以初步判断酒精对霉菌的抑制效果比较好。
采用菌落计数法定量研究酒精的抑菌效果，见表4。
表4 酒精的抑菌结果
由表4可知，酒精的抑菌效果差异性很大，不同浓度的酒精的抑制效果不同，选其作为防腐剂使用，必须选择合适的浓度。另外，实验表明，有些微生物不在酒精的抑制范围内。
2.3.2 酒精和苯甲酸钠的协同抑菌效果
本实验采用的是气球收集气体方法，实验后观察气球膨胀程度，见表5。
表5 不同添加剂及其添加量对产气的影响结果
注：“+”表示产气量的大小，+越多表示产气量越大；“-”表示产气量是+的一半。
由表5可知，在2#、3#、8#、9#的单因素实验中，2#、3#实验现象表明，酒精对微生物存在着抑制作用，但是由于受抑菌范围的影响，对产气微生物的抑制作用不明显。加入3%酒精的3#的产气量明显比1#(对照)多，由此可看出酒精对产气菌的抑制作用需要在特定量范围内。由8#、9#产气现象可知苯甲酸钠对胀罐抑制有一定成效。
在双因素实验(4#、5#、6#、7#)中，抑菌效果很明显。实验表明，添加0.6‰苯甲酸钠和2%食用酒精抑制产气效果最好。同时已有报道指出，酒精可以增加苯甲酸钠在酸性环境中的溶解度，进而提高防腐效果，还可减少苯甲酸钠的添加量。
2.4 灭菌温度对胀罐的抑制情况
表6 温度对胀罐的抑制效果
注：“+”表示产气量的大小，+越多表示产气量越大；“-”表示产气量是+的一半。
由表6可知，80 ℃的灭菌效果最理想，而厂家通常采用的成品灭菌方式一般为80 ℃，30 min。因此，从一定程度上可以说明胀罐发生的原因不是酱油灭菌不彻底，可能是在包装过程中发生的二次污染导致的，这就提示厂家应多注重包装过程中的灭菌工作，如采用辐照杀菌技术、微波杀菌技术等。该实验结果也说明，引起胀罐发生的微生物应为中温菌，高温对其有很好的杀灭作用。
3 小结
实验研究表明，胀罐酱油的酸度和盐含量都在国标范围内，酸度为1.98 g/dL，盐含量为16.43 g/dL；高温灭菌实验表明该微生物不耐高温，80 ℃灭菌30 min，可以在一定程度上解决胀罐问题，而引起问题酱油胀罐的原因很可能是在包装过程中的二次污染；在解决方法上，可以添加0.6‰的苯甲酸钠、2%的食用酒精(93% vol)，在保证防腐效果的同时减少苯甲酸钠的使用量。
