响应面法优化提取丁香中的总黄酮及抗氧化性研究

张玲玲,孙芬芳,张蓉希，王建化

(青岛农业大学 海都学院，山东 莱阳 265200)

丁香为桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，是重要的食用香辛调料。丁香性味辛、温，具有温中降逆、散寒止痛、补肾助阳的功效，也是重要的中药材[1]。丁香中含有丁香酚、丁香油、黄酮等活性成分，是丁香应用于调味食品及药用的主要物质[2,3]。有研究表明[4-8]，黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，能有效阻止人体脂质的自氧化反应，及时清除体内过量的自由基，延缓人体衰老。因此，黄酮类化合物的提取与抗氧化性的研究受到人们的广泛关注。目前，李利华[9]研究正交实验法优选丁香总黄酮的提取工艺，李育博等[10]研究响应面法优化提取野生南果梨果肉中黄酮，刘芸等[11]研究响应面酶法辅助超声提取芫荽总黄酮的工艺，王俊青等[12]研究响应面法优化南方红豆杉叶总黄酮提取工艺，而用响应面法优化丁香中总黄酮的提取工艺及抗氧化性研究较少。因此，本研究利用超声波辅助提取丁香中的总黄酮，通过响应面试验得到最佳提取条件，然后对其抗氧化性进行研究，以期提高对丁香总黄酮的进一步开发与利用价值，为丁香的应用提供了理论依据。

1材料与方法

1.1 实验材料

芦丁标准品：优级纯，购自博美生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, ≥97.0%)：购自福州飞净生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等：均为分析纯，购自国药集团有限公司；丁香：市售。

SB25-12DTN型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TU1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；CP114型分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理

取丁香，干燥，粉碎，过40目筛，备用。

1.2.2 标准溶液的配制

精密称取烘干至恒重的芦丁标准品5 mg，加入浓度为60%的乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。

1.2.3 标准曲线的绘制

分别移取上述芦丁标准溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 10%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，然后加4 mL的4%氢氧化钠溶液，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀。10 min后，在510 nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，芦丁浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，所得回归方程为A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

1.2.4 丁香总黄酮含量的测定

参照文献[9]的方法，根据标准工作曲线，测得总黄酮含量，按照下式计算总黄酮的提取率，每个样品做3次平行实验。

式中：c为测得的总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；M为稀释倍数，m为丁香粉总质量，g。

1.2.5 单因素试验设计

1.2.5.1 乙醇浓度对丁香总黄酮提取率的影响

准确称取5份质量为1 g的丁香粉末于具塞锥形瓶中，分别加入25 mL浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，设置超声提取温度为40 ℃，超声提取时间为40 min，抽滤得浸提液。按1.2.4步骤测定总黄酮的含量，计算总黄酮的提取率，讨论不同乙醇浓度对丁香总黄酮提取率的影响。

1.2.5.2 液料比对丁香总黄酮提取率的影响

准确称取5份质量为1 g的丁香粉末于具塞锥形瓶中，分别按照液料比15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1加入60%的乙醇溶液，设置超声提取温度为40 ℃，超声提取时间为40 min。按1.2.4步骤测定总黄酮的含量，计算总黄酮的提取率，讨论不同液料比对丁香总黄酮提取率的影响。

1.2.5.3 提取时间对丁香总黄酮提取率的影响

准确称取5份质量为1 g的丁香粉末于具塞锥形瓶中，分别加入45 mL 60%的乙醇溶液，设置超声提取温度为40 ℃，超声提取时间分别为30，40，50，60，70 min。按1.2.4步骤测定总黄酮的含量，计算总黄酮的提取率，讨论不同提取时间对丁香总黄酮提取率的影响。

1.2.5.4 提取温度对丁香总黄酮提取率的影响

准确称取5份质量为1 g的丁香粉末于具塞锥形瓶中，分别加入45 mL 60%的乙醇溶液，然后将5个具塞锥形瓶置于超声波清洗机中超声，设置超声提取时间为60 min，超声提取温度分别为40，45，50，55，60 ℃。按1.2.4步骤测定总黄酮的含量，计算总黄酮的提取率，讨论不同提取温度对丁香总黄酮提取率的影响。

1.2.6 响应面试验设计

根据以上的单因素试验结果，依据Box-Benhnken试验设计原理，以总黄酮的提取率为响应值，在乙醇浓度、液料比、提取时间3个单因素的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，各因素和水平设计见表1。

表1 响应面设计因素及水平表

1.2.7 DPPH自由基清除活性

参考马莎莎等的测定方法并略作改动。准确称取适量 DPPH 粉末用乙醇溶解并定容，配制成0.071 mmol/L的DPPH 溶液。取1 mL不同浓度的样品提取液及0.071 mmol/L的DPPH 溶液4 mL，用乙醇定容至10 mL，室温下暗处反应30 min，在517 nm处测定吸光度。以相应浓度的Vc做对照，计算样品的DPPH 自由基清除率。

式中：A0为未加样的DPPH的吸光度；Ai为待测样品与DPPH反应后的吸光度;Aj为未加DPPH的样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对丁香总黄酮提取率的影响

图1 乙醇浓度对丁香总黄酮提取率的影响

由图1可知，乙醇浓度为30%～60%，总黄酮的提取率稳步上升，并在乙醇浓度为60%时达到最高，分析原因可能是总黄酮在乙醇中的溶解度随乙醇浓度上升而上升。乙醇浓度为60%～80%，总黄酮的提取率慢慢下降，分析原因可能是乙醇浓度过高使丁香中的部分其他物质析出增加，影响黄酮类化合物的溶出。因此，从总黄酮的提取率考虑，选取乙醇的浓度为60%。

2.1.2 液料比对丁香总黄酮提取率的影响

图2 液料比对丁香总黄酮提取率的影响

由图2可知，液料比(mL/g)在15∶1～45∶1，总黄酮的提取率一直保持快速上升状态，分析原因可能是增大溶剂量，加大接触面积，促进丁香中总黄酮的有效浸提。在液料比超过45∶1 (mL/g)以后，提取率逐渐下降，分析原因可能是液料比为45∶1 (mL/g)，丁香中的总黄酮已基本溶出，继续增大液料比，可能会有部分物质溶出并阻碍了总黄酮的析出。因此，从总黄酮的提取率考虑，选取液料比为45∶1 (mL/g)。

2.1.3 提取时间对丁香总黄酮提取率的影响

图3 提取时间对丁香总黄酮提取率的影响

由图3可知，提取时间在30～60 min，提取率一直保持上升，60 min以后提取率慢慢下降，分析原因可能是在提取时间60 min以内，丁香与乙醇充分接触，接触时间越长，总黄酮溶出量越多，到60 min时总黄酮已基本溶出。提取时间超过60 min，随着时间的延长，部分黄酮化合物发生了分解或者降解[13]。因此，从总黄酮的提取率和稳定性考虑，选取最佳提取时间为60 min。

2.1.4 提取温度对丁香总黄酮提取率的影响

图4 提取温度对丁香总黄酮提取率的影响

由图4可知，提取温度对丁香中总黄酮提取率的影响比其他因素略小。提取温度由40 ℃上升到50 ℃，提取率缓慢上升，提取温度由50 ℃上升到60 ℃，提取率缓慢下降。分析原因可能是提取温度在50 ℃以内，温度升高，加快了丁香中分子的运动速率，总黄酮的溶出量增加。提取温度超过50 ℃，随着温度的上升，使浸提液中部分成分与总黄酮发生了反应，减少了有效成分[14]。因此，从总黄酮的提取率和稳定性考虑，选取最佳提取温度为50 ℃。

2.2 响应面分析及试验结果

响应面试验设计与结果见表2。

表2 响应面试验设计及数据处理

利用Design-Expert V8.0.6软件对表2中数据进行多元回归方程拟合，得到丁香总黄酮提取率(Y)对自变量液料比(A)、提取时间(B)和乙醇浓度(C)的二次多项回归方程：

Y=+12.12+0.31A+0.25B+0.33C-0.34AB-0.067AC+0.31BC-1.34A2-1.52B2-1.86C2。

表3 回归方程方差分析表

注：“*”表示P<0.05，显著；“**”表示P<0.01，极显著。

由表3可知，模型的P<0.0001，显示模型极显著，此模型中失拟性不显著(P>0.05)，表示此模型设计的预测值与实际值相近，有良好的线性关系，根据此模型可以得到丁香中总黄酮提取的最优工艺。由表3中F值可知，各因素对丁香总黄酮提取率的影响因素大小顺序是：C(乙醇浓度)>A(液料比)>B(提取时间)。其中，一次项A，C、二次项A2、B2、C2对试验结果的影响极显著(P<0.01)，一次项B、交互项AB、BC对试验结果的影响显著。

通过Design-Expert V8.0.6软件，输入试验结果可得到图5的响应曲面图。

图5 两因素间的交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图

图5非常直观地表现了液料比与乙醇浓度、液料比与提取时间、乙醇浓度与提取时间两两因素间的交互作用。响应曲面图中图形陡峭程度越小代表相互作用越小，反之则越大[15]。由图5可知，两两因素间均有一定的交互作用，其中AB和BC的交互作用更显著，这与表3中的显著性结果一致。

2.3 总黄酮最佳提取工艺条件的验证

通过Box-Behnken试验设计，得到超声提取丁香总黄酮的最佳工艺条件为：液料比46.04∶1(mL/g)，提取时间60.80 min，乙醇浓度60.92%，在该条件下总黄酮的理论提取率是12.16%，为方便验证该方法的可行性，采用上述条件的调整值：液料比46∶1(mL/g)，提取时间61 min，乙醇浓度61%，对丁香中的总黄酮进行提取。结果表明：超声辅助提取丁香中的总黄酮平均提取收率(n=3)为12.11%，RSD=0.38%。结果与软件分析得到的理论值相近，证明试验模型选择可靠，此提取工艺可行。

2.4 DPPH自由基清除活性

按以上提取工艺条件提取丁香中的总黄酮，配制不同浓度的溶液，按1.2.7试验方法研究总黄酮的抗氧化性。丁香总黄酮和Vc的DPPH自由基清除率结果见图6。

图6 丁香总黄酮DPPH自由基清除效果

由图6可知，丁香总黄酮和Vc对DPPH自由基都具有明显的清除效果，且随着浓度升高而逐渐增加。在试样浓度小于0.3mg/mL时，Vc的清除率明显大于丁香总黄酮的清除率。当试样浓度大于0.3mg/mL时，丁香总黄酮与Vc的清除率越来越接近，丁香总黄酮的清除率达到90%以上，这与黄晶玲等的研究结果一致。

3 结论

本文采用超声波辅助提取法从丁香中提取总黄酮，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色，测定总黄酮标准曲线为： A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

通过响应面试验设计优化丁香总黄酮的提取工艺，以总黄酮的提取率作为考核标准，得到最佳条件为乙醇浓度61%，液料比46∶1(mL/g)，超声提取时间61 min，超声提取温度50 ℃。该方法简单快速，提取率高，为丁香中总黄酮的应用前景提供了保障。

DPPH自由基清除试验表明，丁香总黄酮对DPPH自由基具有明显的清除效果，且随着浓度升高而逐渐增加。丁香总黄酮的浓度大于0.3 mg/L时，清除率达到90%以上。