浙江镜湖湿地3种菌根植物根部真菌群落多样性及对金属元素富集能力的研究

王 晔 李 航 汤 宇 单梦乐 张飞燕 孙立夫 张艳华

(绍兴文理学院生命科学学院，绍兴 312000)

土壤是陆地生物赖以生存的基础。近年来，工农业生产和交通运输导致土壤污染越来越严重。中国南方地区长期受到酸雨的影响，导致土壤的酸化，以及由此引发的金属离子的活化，加大了生态系统自我修复的难度。由于重金属不能被土壤微生物消解，只能在环境中迁移和转化，当积累到一定程度就会产生毒害，破坏土壤的理化性质，进而通过食物链，危及生态系统安全和人类健康[1]。城市湿地的存在对净化环境，减少重金属的危害起到了一定的调节作用。菌根是植物根系与土壤真菌形成的互惠共生体，绝大多数的维管植物都能形成菌根[2]。菌根植物在污染土壤的修复中被认为是具有积极作用的[3]。

具有外生菌根(ECM)的宿主植物经常是我国亚热带森林中的主要建群种，如松科(Pinaceae)和壳斗科(Fagaceae)的植物[4]，杜鹃花类菌根(ERM)的宿主——杜鹃花科(Ericaceae)植物常常与优势种相伴而生，而禾本科(Poaceae)、菊科(Asteraceae)等植物是常见的林下、林缘、田间的主要草本植物，且常具有丛枝菌根(AM)结构[5]。因不同类型植物在菌根结构和真菌组成方面各有特点，对重金属和有害金属的毒害反应和相应的抵御机制也有不同[3,6～9]。本文以绍兴市镜湖城市湿地公园为研究样地，以次生林下AM宿主植物黑麦草(LoliumperenneL.)、六月霜(MonochasmasauatieriFranch)和ERM宿主植物乌饭树(VacciniumbracteatumThunb)为研究对象，分析这3种宿主植物根部真菌群落的组成和结构，特别是其功能菌群的建立情况，及其与几种金属元素之间的相关关系，不同宿主植物对土壤金属元素富集的能力进行比较，以期为城市湿地环境中植物菌根真菌群落组成和结构的深入研究以及环境保护提供一定的参考。

1 研究方法

1.1 研究样地的设置

在镜湖城市湿地公园的梅山和人工绿化园区，根据植被分布的情况，合理布局取样点。选择具有代表性的30个以上的地段，采集土壤样品进行重金属种类分析和含量测定。AM植物黑麦草和六月霜，ERM植物乌饭树，每种选择6株以上的样株。每各样点距离在15 m以上。

1.2 样品的采集

在次生林中，分别选取了自然生长的黑麦草、六月霜和乌饭树各7、6和7个样株，相同种类的两个样株距离15 m以上，共采集植物毛根样品20份。在采集毛根的同时，也采集各样株的根、茎、叶(黑麦草茎叶合一)共53个样品。在人工园区和次生林下分别采集了(-5～-20 cm)10和24个土壤样品。

1.3 毛根样品的处理

将采集ERM和AM宿主的毛根，蒸馏水洗净，用天根生化科技有限公司的新型植物基因组提取试剂盒进行DNA提取，PCR扩增，具体方法详见Zhang等的研究[10]，电泳检测扩增产物，并将确定有扩增产物的DNA样品，低温保存，送上海美吉生物医药科技有限公司(Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd)测序，选择Illumina Miseq PE250平台，引物为真菌特异性引物ITS1F-ITS2R，每样品提供≥3万条reads。

1.4 金属元素含量的测定

精确称取烘干、研磨和过筛后的根、茎、叶和土壤样品各0.5 g，用硝酸—高氯酸和王水—高氯酸分别对植物组织和土壤进行消解，消解后的产物在比色管中加双蒸水定容至10 mL，用美国利曼Prodigy XP型电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定样品中的元素含量。选择Al、Zn、Cu、Cr、K共5种元素进行检测。

1.5 数据分析

金属元素含量的ANOVA分析和多重比较等在SPSS22.0中进行，根部真菌群落，如种类组成、多样性、主坐标分析(PCoA)、典型相关分析(CCA)等及作图均在上海美吉生物医药科技有限公司的云平台上(r软件包)进行。

2 结果与讨论

2.1 公园土壤中5种金属元素含量的比较

为了了解JCWP土壤重金属含量的现状，在公园不同位置收集了34份土壤样品，测量了Al、Cr、Cu、K、Zn元素在人工绿化园区和次生林土壤中的含量(表1)。

由表1可知，5种元素含量在两种生境中都有极显著差异(P≤0.01)，且这5种金属元素含量均在人工绿化园区土壤中更高。分析原因可能是与人工园区相比，次生林下物种组成多样，植被结构复杂，多年生植物较丰富，能吸收更多重金属及有害金属，对土壤金属的富集和转移能力更强。总体上，公园内次生林下重金属污染程度不高。

表1 公园土壤中金属元素含量的比较

注：**表示差异显著(P≤0.01)，下表同。

Note:**showed significant difference(P≤0.01),the same as below.

表2 3种植物不同部位金属元素含量一览表

2.2 植物对金属元素富集的比较

在植物物种之间和不同取样部位之间的金属元素含量进行统计(表2)。

每种金属含量在3种植物相同部位间进行ANOVA分析，和LSD、S-N-K及Duncan多重比较。结果显示：Al含量在植物种类之间有显著差异(P<0.05)，乌饭树富集更多的Al，与茎部相比更多地集中在根部和叶部。K、Cu、Zn、Cr含量在植物种类间都有极显著差异(P<0.01)。六月霜作为一种中药材对K、Cu元素的富集能力较强，且都在叶中最高，同时叶中Zn和Cr含量也极高。如果根据国家食品安全卫生标准(GB2715-2016)规定，新鲜蔬菜中的Cr含量不得超过0.5 mg·kg-1的标准，按照这样的标准，镜湖湿地梅山上的六月霜是不适宜入药的。黑麦草对Cr的富集能力也很强，且主要集中在根部。两种AM菌根类型的草本植物生长状态良好，对Cr的富集均高于ERM植物。在ERM的抗重金属的诸多研究中更常见的是其对在Zn和Cu[11～12]、Cu和Ni[13]、As和Cu[3]、Pb和Cu[14]等污染的土壤中都表现出很强的抵抗力和进化适应能力，及其在Al活跃的酸性土壤中出色的表现[3]，本研究结果也证明了乌饭树这一酸性土壤中的常见伴生物种，对Al有很好的富集和耐受能力。作为菌根植物，它们对金属元素的富集特点是否与其菌根真菌的作用有关？我们对自然分布在JCWP次生林下不同位置的样株进行了根部真菌群落组成和结构的分析。

2.3 3种植物根部真菌群落的组成和结构

对黑麦草、六月霜和乌饭树共20个样本进行了高通量测序，分类学信息见表3。

表3 3种植物根部真菌的分类学信息一览表

Table 3 Taxonomic information of fungi associated with roots of three plant species

植物名称Plant name门Phylum纲Class目Order科Family属GenusOTUs黑麦草L.perenne62357114187472六月霜M.sauatieri72258113176466乌饭树V.bracteatum72557107165442

图1 乌饭树根部真菌群落组成(目水平)Fig.1 Fungal community composition in root of V.bracteatum(Order level)

据表3可知，3种植物根部的真菌属于6个真菌门，分别是Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Glomeromycota、Zygomycota、unclassified_ Fungi(未分类真菌)。而六月霜和乌饭树根部还有少量Rozellomycota。3种植物在各分类等级中的数目都大体相同或相近，且3种植物均以Ascomycota为优势真菌。Glomeromycota作为典型的AM真菌[5]在黑麦草和六月霜根部真菌群落中的占比很少，群落组成中杂菌多，功能菌少；而公认的典型ERM真菌Ascomycota的Helotiales[7]和Oidiodendron的真菌[15]，以及Basidiomycota中的Sebacinales[16]在乌饭树根部真菌群落中都出现，真菌群落中还有少量的ECM真菌，如Sclerodermataceae，Thelephoraceae。有趣的是在7个乌饭树样株根部群落中Helotiales和Sebacinales的占比有很大差别，除V1外，其他6个样株中这两个公认的ERM真菌目有此消彼长的互补态势如图1，功能性菌群已经建立，而且比重很高，可能较好地发挥ERM菌根在酸性土环境中营养吸收和抵抗重金属等方面的作用[17]。

3种植物根部真菌共有和特有的OTUs见Venn图2。从图2中可知黑麦草、六月霜和乌饭树的OTUs分别为466、472和442，其特有的OTUs分别为222、213和258，而三者共有的OTUs为87。其中AM菌根植物六月霜与黑麦草共有的OTUs为203，总体上根部真菌种类组成在物种级别上的差异是很大的，可能与植物物种之间亲缘关系较远有关。

图2 3种植物根部真菌OTUs的组成 L.黑麦草；M.六月霜；V.乌饭树Fig.2 Composition of OTUs from fungi associated with roots of three plants L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

进一步对3种植物根部真菌群落进行PCoA排序，得到两个主成分PC1和PC2其贡献率分别为16.78%和12.73%(图3)。从图3可知，黑麦草、六月霜和乌饭树根部真菌群落样本之间的OTUs组成和结构分化明显，在PC1中ERM的乌饭树和AM的六月霜和黑麦草有明显区分，乌饭树的根部真菌群落位于右侧，而黑麦草和六月霜依次位于中部和左侧，说明不同菌根类型差异还是明显的；PC2中又将乌饭树和六月霜与黑麦草明显划分为上下两个半区，说明即使是相同的菌根类型，由于物种分类学关系较远，其根部内生菌的组成和结构也有显著分异。

图3 3种植物根部真菌群落(OTUs水平)PCoA排序Fig.3 PCoA of OTUs from fungi associated with roots of three plants

图4 各样本(OTUs水平)Shannon指数 L.黑麦草；M.六月霜；V.乌饭树Fig.4 Shannon index of simples with OTUs level L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

表4 3种植物根部真菌平均多样性指数一览表

Table 4 Averaged diversity index of fungi associated with roots of three plant species

植物名称Plant nameShannonSimpsonAceChaoCoverage黑麦草L.perenne2.350.178142.50142.41.000六月霜M.sauatieri1.430.462169.45169.80.999乌饭树V.bracteatum1.940.258110.80109.51.000

对3种植物根部真菌群落进行Alpha多样性分析，比较各宿主根部真菌群落的平均丰度和多样性指数(表4)。

测序深度指数Coverage(样本文库的覆盖率)越高，表明样本中序列被测出的概率越高，我们的样本都在0.999以上。Chao和Ace是菌群丰度指数，其值越高表明丰度越高，Shannon和Simpson是菌群多样性指数，前者值越高表明菌群多样性越高，后者相反，值越低意味着菌群多样性越高。从表4可知六月霜的真菌群落平均丰度最高，多样性最低，而黑麦草多样性最高，乌饭树的丰度最低。图4能更清楚地看到3种植物20个真菌群落样本Shannon多样性指数的具体表现。

2.4 3种植物根部真菌群落和元素含量之间的关系

为了进一步说明根部真菌群落与所测环境土壤中金属元素含量之间的关系，我们对所得数据进行了典型相关分析(Canonical Correlation Analysis，CCA)，由于很多OTUs不能鉴定到更低的单位，我们以目水平为基础建立物种、真菌样本和土壤环境因子中5种元素含量之间的CCA分析(图5)。箭头表示元素种类，箭头的长短可以代表元素对于物种数据的影响程度，箭头间的夹角代表正、负相关性(锐角为正相关；钝角为负相关；直角为无相关性)，角度越小相关性越密切。由图5可知，土壤中Al、Cu和K对真菌目水平的影响程度较高，Zn和Cr相对较弱。除一个样本外，乌饭树的其余6个真菌群落样本均与Al、K、Cu和Cr呈正相关关系，与Zn不相关；黑麦草中有5个样本与Zn正相关，与其他4种元素几乎都不相关。六月霜多数样本与Al、Zn和Cr呈负相关关系。

对3种植物根部目水平的真菌与土壤中的金属元素进行相关性分析，并将具有显著影响的和两个公认的ERM真菌目的Pearson相关性系数列于表5中。从表5中可知，样本中与Cr有显著正相关的有两个真菌目，有显著负相关的只有Atractiellales。与Zn和K有显著正相关的分别有3个真菌目，而与Al均无显著相关。Helotiales和Sebacinales作为典型常见的ERM真菌，与所测各元素均无显著相关，也进一步说明了它们对环境因子不敏感，在南北半球不同生态系统中都有广泛分布的事实[18～23]。而黑麦草和六月霜在AM功能菌欠缺的情况下，植物本身仍然具有较强的环境适应能力。

图5 环境因子、真菌群落和样本(目水平)的CCA排序 L.黑麦草；M.六月霜；V.乌饭树Fig.5 CCA ordination of environmental factors, fungal communities and samples(order level L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

表5 3种植物根部真菌(目水平)与土壤中五个金属元素Pearson相关性系数

Table 5 Pearson correlation coefficients between root fungi (order level) of three plants and five metal elements in soil

目orderAlCrCuKZnArchaeorhizomycetales0.1310.1450.083 0.473∗-0.246 Atractiellales-0.443-0.460∗-0.557∗-0.352-0.340Capnodiales0.1590.447∗0.3610.3570.266Cystofilobasidiales0.2610.2460.199-0.1410.649∗∗Eurotiales0.1750.0430.1960.529∗-0.228Georgefischeriales0.0960.0690.162-0.2320.621∗∗Helotiales0.4020.2070.3550.2480.194Hypocreales0.2640.565∗∗0.1510.1070.358Microascales0.1700.1490.0560.484∗-0.208Mortierellales0.0580.0190.149-0.2340.590∗∗Saccharomycetales0.1630.1730.0930.528∗-0.242Sebacinales0.078-0.0080.0990.409-0.236Sporidiobolales0.4240.484∗0.1590.0680.278

*0.01

3 结论

在浙江镜湖城市湿地公园人工绿化园区比在园内梅山次生林土壤中Al、Cr、Cu、K和Zn的含量更高，次生林土壤状态良好。对次生林中自然生长分布的3种菌根植物进行金属元素富集能力的比较，发现ERM宿主植物乌饭树能富集更多的Al，而AM宿主植物黑麦草和六月霜Cr的富集能力都更强，说明不同菌根类型宿主植物对金属元素富集能力有较大差异。3种植物根部真菌群落中都表现出Ascomycota占优势，而在乌饭树毛根中Basidiomycota也是真菌群落中的主要组成部分。黑麦草和六月霜根部群落中AM真菌组分很少，功能菌群尚未建立，而乌饭树根部公认的ERM真菌——Helotiales和Sebacinales在群落结构中占较大优势，且出现互补态势。CCA分析乌饭树根部真菌群落样本与Zn以外的土壤其他4种金属元素含量都呈正相关关系，但是Helotiales和Sebacinales与5种元素之间相关性均不显著，进一步说明这两个公认的ERM真菌目与杜鹃花科宿主一起可以在全球多种生境中广泛分布的事实。

致谢野外样品采集和实验过程中得到了汤访评、韩丽和金叶飞老师的大力支持，特此致谢。