酸枣仁药材UPLC指纹图谱研究

雷桥仕， 魏梅， 孙冬梅， 梁慧， 童培珍， 王燕雄， 官永河

（广东一方制药有限公司，广东佛山528244）

酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子[1]，主要分布在我国辽宁、河北、河南、山东、山西等地区。中医临床常以酸枣仁为君药组方治疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症。研究表明，酸枣仁含有皂苷类、黄酮类、生物碱、脂肪酸、氨基酸、酸枣多糖及微量元素[2，3]，具有镇静、催眠、降压、降血脂等多种药理作用[4-6]。由于其良好的疗效及广泛的临床应用，市场需求量增大、价格上涨，导致出现伪品及掺伪品。目前，酸枣仁药材甄伪鉴别主要依赖于性状、显微及薄层色谱鉴别，而理枣仁色泽质地与酸枣仁极为相似，且有学者认为理枣仁亦含有酸枣仁的主要有效成分[7，8]，带来了甄别上的困难，故急需在指纹图谱技术指导下开展全成分质量控制研究。文献报道酸枣仁指纹图谱研究主要为高效液相色谱—蒸发光散射检测器（HPLCELSD）指纹图谱以及部分低波长高效液相色谱—紫外分光光度（HPLC-UV）指纹图谱[9，10]，其虽然分析信息全面，但是检测信号基线漂移严重，容易丢失峰信息且精密度较差。因此，本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法进行酸枣仁指纹图谱研究，建立更快速、稳定且重现性好的方法，以期为酸枣仁药材质量控制提供科学的新方法，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司，PDA检测器），Empower 3.0色谱工作站。Waters ACQUITYUPLCTMI-Class型超高效液相色谱仪；沃特世超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统（Xevo G2-XSQ-TOFMS），UNIFI 1.8工作站（英国曼彻斯特Waters公司）；ME204E万分之一分析天平、XP26百万分之一分析天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS28恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；Milli-QDirect超纯水系统（美国默克股份有限公司）。

1.2 试剂 乙腈（默克股份有限公司，色谱纯）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；甲醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯）；水为超纯水；斯皮诺素（批号：B221711108，含量：98%，中国食品药品检定研究院）；木兰花碱（批号：150813，含量：≥98%，成都普菲德生物科技有限公司）。

1.3 试药 酸枣仁药材S1～S18为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，理枣仁药材L19～L23为鼠李科植物滇刺枣zizyphuomauritsana Lam.的干燥成熟种子，见表1。酸枣仁对照药材（批号：121517～201604，中国食品药品检定研究院），经广东一方制药有限公司质量中心鉴定。

表1 酸枣仁及理枣仁药材产地信息Table 1 Information of habitats of Semen Ziziphi Spinosae and Semen ZiziphiMauritianae sam p les

2 方法与结果

2.1 液相色谱及质谱参数

2.1.1 UPLC条件 色谱柱为Waters Cortecs T3（100mm×2.1mm，1.6μm）。以乙腈（A）—0.05%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱：0～7min，3%～15%A；7～10min，15%～17%A；10～15min，17%～17%A；15～20 min，17%～25%A；20～25 min，25%～90%A。柱温：35℃；检测器：PDA；检测波长：254 nm；流速：0.4mL/min；进样体积：1μL。

2.1.2 质谱参数 氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800 L/h；扫描时间：0.5 s；扫描时间间隔：0.02 s；质荷比范围：50∶1 200；数据采集模式：ESI（+/-）下采集MSE；以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽（leucine-enkephalin）为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50 L/h。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取斯皮诺素、木兰花碱对照品适量，用甲醇配制成每1mL含斯皮诺素20μg、木兰花碱15μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取酸枣仁药材粉末（过65目筛）1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加体积分数70%甲醇20mL，称定质量，加热回流提取60min，放冷。再称定质量，用体积分数70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下的液相色谱条件连续进样测定，记录指纹图谱。结果显示，各色谱峰的相对保留时间相对标准偏差（RSD，sR）均＜3%，相对峰面积sR均＜5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 按“2.3”项下的方法制备供试品溶液6份，“2.1”项下的液相色谱条件进样测定，记录指纹图谱。结果显示，各色谱峰的相对保留时间sR均＜3%，相对峰面积sR均＜5%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下的液相色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录指纹图谱。结果显示，各色谱峰的相对保留时间sR均＜3%，相对峰面积sR均＜4%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.5 结果与分析

2.5.1 酸枣仁色谱峰的液相色谱—质谱（LC-MS）鉴定 酸枣仁及理枣仁药材的指纹图谱比较见图1。本研究按拟定的液相色谱及质谱条件，通过对照品比较和UPLC-Q-TOF-MS技术共鉴定了药材中的9个色谱峰，包括了3个生物碱类和6个黄酮类成分，其中峰7、峰8分别为R型或S型的N-glcindoleacectic Acid，峰9为木兰花碱，峰12为Isospinosin，峰13为斯皮诺素，峰20为6'''-pcoumaloylspinosin，峰21为6'''-feruloylspinosin，峰22、峰23分别为R型或S型6''-O-（3-glc-indoleacetyl）spinosin。见表2。由于斯皮诺素色谱峰的保留时间适中且分离度良好，并且是酸枣仁主要的活性成分，所以确定以斯皮诺素为参照峰（S），计算其它色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。19批酸枣仁药材和5批理枣仁药材的相对峰面积结果见表3。

图1 酸枣仁、理枣仁和酸枣仁对照药材的UPLC指纹图谱比较Figure 1 Com parison of the UPLC finger-prints of Semen ZiziphiSpinosae，Semen ZiziphiMauritianae and reference sam ple of Semen ZiziphiSpinosae

表2 相关色谱峰的指认[12，13]Table 2 Identification of the related chromatographic peaks

2.5.2 酸枣仁药材及理枣仁的UPLC指纹图谱相似度分析 由图1可知酸枣仁与理枣仁药材的指纹图谱较为相似，说明酸枣仁与理枣仁的化学成分较为相似，与文献报道的较为相似[7，8]。因此，需要进一步对酸枣仁与理枣仁进行鉴别。将收集于不同产地的18批酸枣仁药材和5批理枣仁药材样品的UPLC指纹谱图数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，以酸枣仁对照药材为参照图谱并计算24批药材的相似度。结果显示酸枣仁药材的相似度较高，均大于0.97，而理枣仁药材的相似度较低，均小于0.90。见表4。

2.5.3 酸枣仁及理枣仁的UPLC指纹图谱聚类分析及主成分分析 将收集于不同产地的18批酸枣仁和5批理枣仁药材样品的相对峰面积导入IBM SPSSStatistics 19.0软件进行聚类分析及主成分分析。聚类分析结果显示，24批样品可明显分为2大类，见图2-A。山西、河北、山东、辽宁等产地的酸枣仁药材聚成一大类，且产地差异不明显，对照药材与山西运城的S1样品聚为一小类，推测山西运城的酸枣仁药材质量优于其他产地。此外，收集于不同地区的理枣仁药材聚为一类，说明理枣仁药材质量的相似性，可能均为同一个品种或来源于同一个产地。另外，编号为S8的酸枣仁与理枣仁聚为一大类，推测S8批次酸枣仁药材可能为伪品或者掺伪品。PCA得分图见图2-B，可以发现24批样品主要分为2组，来自道地产区的酸枣仁分为Ⅰ组，理枣仁分为Ⅱ组，因此主成分分析能够有效区分酸枣仁与理枣仁，与相关研究结论较为相似[11]。另外编号为S8、S10两批酸枣仁的分布介于酸枣仁与理枣仁之间，可以推测S8、S10为伪品或者掺伪品，与聚类分析结果互为一致。结果表明，聚类分析和主成分分析能够明显区分酸枣仁和理枣仁，并且还可以推测部分酸枣仁为伪品或者掺伪品。

2.5.4 酸枣仁药材的UPLC指纹图谱建立 结合前期相似度分析、聚类分析及主成分分析结果，排除推测为掺伪品的2批样品和对照药材后，将第Ⅰ组16批样品的酸枣仁UPLC色谱图依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，建立酸枣仁药材的对照指纹图谱，结果显示酸枣仁药材具有26个共有峰。见图3、4。

表3 19批酸枣仁药材和5批理枣仁药材的相对峰面积Table 3 The related peak area of 19 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam ples

表4 19批酸枣仁和5批理枣仁的相似度结果Table 4 Sim ilarity of19 batches of Semen Ziziphi Spinosae sam ples and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam p les

图2 不同产地酸枣仁和理枣仁的聚类分析图（A）和PCA得分图（B）Figure 2 The cluster analysis（A）and principal com ponentanalysis（B）results of Semen Ziziphi Spinosae samp les and Semen ZiziphiMauritianae sam p les from differenthabitats

图3 16批不同产地酸枣仁药材UPLC指纹图谱叠加图Figure 3 The overlaying graph of UPLC finger-printof 16 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les from differenthabitats

图4 酸枣仁药材UPLC对照指纹图谱Figure 4 The reference UPLC finger-printof16 batches of Semen ZiziphiSpinosae samples from differenthabitats

3 讨论

本课题组前期实验对酸枣仁药材进行了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇及70%乙醇等溶剂考察，结果以70%甲醇提取色谱峰数目较多、峰形较好且溶剂效应较小，故本研究选择70%甲醇为溶剂。结合文献研究，前期实验选取了204、335、254 nm等波长进行对比研究，结果204 nm波长下的色谱图基线漂移，335 nm波长下的峰信息较少，以波长为254 nm的色谱图基线平稳且峰信息容量较大，故本研究选择254 nm波长。另外，本研究选取了乙腈—水、乙腈—0.05%乙酸、乙腈—0.05%甲酸等流动相进行对比，结果显示以乙腈—水为流动相的色谱图部分色谱峰拖尾严重，以乙腈—0.05%甲酸为流动相的色谱图分离效果最佳。

酸枣仁道地产区或主要产区主要为冀、鲁、晋、陕等地。由于酸枣仁的用量较大，市场价格持续上涨，渐渐出现以理枣仁替代酸枣仁的现象。理枣仁为《中华人民共和国药典》酸枣仁项下未收录的品种，是市场用量较小、价格便宜的地方习用品。其外观与酸枣仁相似，主成分差别不大。本研究通过相似度评价、聚类分析和主成分分析表明，采集于不同地方的理枣仁与酸枣仁的区别明显，凸显出来不同基源的品种差异性，为鉴定酸枣仁的真伪提供了科学依据。另外，来自不同道地产区或主产区酸枣仁的相似度较高，说明酸枣仁药材质量总体差异不大，可为企业选址购买药材及指导GAP建设提供科学性的建议。

本研究结果发现，酸枣仁药材UPLC指纹图谱具有26个共有峰，以LC-MS鉴定了其中的9个色谱峰，包括3个生物碱类和6个黄酮类成分，各批次酸枣仁药材所含成分基本一致，相似度极高。本研究建立了能快速评价酸枣仁质量的UPLC指纹图谱方法，可为酸枣仁药材质量控制提供科学的新方法。