滋肾降糖丸对1型糖尿病骨质疏松大鼠骨组织miRNAs表达谱的影响

李增英， 赵恒侠， 刘雪梅， 渠昕， 李惠林

（深圳市中医院内分泌科，广东深圳518033）

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一种以高血糖为特征的代谢紊乱综合征。越来越多的证据表明，骨质疏松是糖尿病的并发症之一，在老年人群中普遍存在并且可能在未来继续增加，其特征是骨质和结构恶化。1型糖尿病患者的整个生命过程与骨折风险增高密切相关[1]。Meta分析显示1型糖尿病患者的骨密度（BMD）是降低的，其骨折风险大于2型糖尿病患者[2]。在分子水平上，细胞因子如白细胞介素（IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和叉头框蛋白（FoxO）转录因子被发现与骨丢失有关[3，4]。目前，miRNAs在糖尿病骨质疏松（diabetic osteoporosis，DOP）发生发展中的分子机制成为研究热点。

微小RNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA，大小为22 nt，通过靶向mRNA的3’非编码区（UTR）调节基因表达的作用，导致mRNA降解和/或蛋白质翻译抑制[5]。研究表明，miRNAs参与骨质疏松性骨折[6]。血清miRNAs微阵列显示，miRNAs可作为生物标志物区分2型糖尿病绝经后妇女的分化性骨折状态[7]。miR-378过表达可靶向Casp3激活磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路从而逆转高糖对成骨细胞活力和分化的抑制作用[8]。这些发现表明高糖条件下的miRNAs与骨质疏松性骨折之间存在关联。

滋肾降糖丸是由黄芪、生地黄、五味子、淫羊藿、枸杞子等14种中草药组成的本院内制剂（批准文号：粤Z20070085），具有益气养阴、补肾壮骨的作用，符合从“肾主骨”理论入手治疗骨质疏松，是用于治疗糖尿病的有效方剂。本课题组前期研究发现，滋肾降糖丸具有明确的降糖调脂作用，且能提高胰岛素敏感性，同时还能够抗氧化、保护血管内皮、降低炎症因子水平等[9，10]。在抗骨质疏松方面，滋肾降糖丸能明显改善DOP患者的临床症状及体征，并且能调节患者的糖代谢紊乱，减少血清钙磷流失，进而改善骨代谢，促进骨形成，抑制骨吸收，提高骨密度[11，12]。而滋肾降糖丸含药血清能通过下调人脂肪酸结合蛋白4（FABP4）及氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ 2）的表达抑制小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成脂分化，上调Runx2和Bmp-2基因表达，促进BMSCs成骨分化，发挥多靶点抗骨质疏松作用[13，14]。最近的一项研究证实滋肾降糖丸可通过改善糖代谢、骨代谢异常对DOP产生有益的作用，但滋肾降糖丸在糖尿病相关骨生成中作用的证据仍然有限。因此在本研究中，我们试图证实滋肾降糖丸在DOP治疗中的成骨作用，并通过miRNAs测序探讨滋肾降糖丸治疗是否可调节DOP大鼠骨组织miRNAs的表达，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级7～8周龄健康雄性Wistar大鼠12只，体质量150～180 g，购自广东省实验动物中心。动物质量合格证号：44005800005605，在广州永诺生物SPF级别动物实验室培养，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0186。

1.2 药物与试剂 滋肾降糖丸（深圳市中医院提供，批准文号：粤Z20070085）。链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）；羧甲基纤维素钠（上海生工）。β-I型胶原羧基端肽（β-CTX）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、骨钙素（OC）ELISA试剂盒（上海Usbiological公司）、骨硬化蛋白（sclerostin）ELISA试剂盒（上海ENZO公司）；Wako诊断甘油三酯（TG）试剂盒（molecular probes，美国Invitrogen公司）；Amplex®Red总胆固醇（TC）分析试剂盒（molecular probes，美国Invitrogen公司）；糖化血红蛋白（HbAlc）试剂盒（瑞士Roche公司）；定量ELISA试剂盒（美国RD公司）；TRizol试剂（USA Thermo Scientific公司）；M1705 M-MLV Reverse Transcriptase、A6002 GoTaq®qPCR Master Mix（美国Promega公司）；TruSeq小RNA文库制备试剂盒（Illumina，CA，USA）；M-MLVReverseTranscriptase试剂盒（北京Promega公司）；ChamQ SYBR qPCR MasterMix（南京Vazyme公司）。

1.3 仪器 血糖检测仪（美国强生公司）；高速台式离心机（美国Beckman公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）；W81507Hologic DXA设备（美国Hologic Discovery公司）；双能X线骨密度仪（美国GE公司）；HemaTGL-16R冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；Illumina HiSeq平台（美国Illumina公司）；TaqMan 7500实时PCR系统（美国Applied Biosystems公司）。

1.4 DOP模型的构建与给药 将12只大鼠适应性饲养1周后以抽签法随机分为正常组、模型组和滋肾降糖丸组，每组4只。正常组大鼠给予腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，模型组和滋肾降糖丸组大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素STZ（55mg/kg）。连续注射1周后，禁食12 h后剪尾采血测量空腹血糖，选取空腹血糖达到16.7mmol/L的大鼠被判断为造模成功。滋肾降糖丸组给予滋肾降糖丸水溶液（剂量为1.5 g·kg-1·d-1）灌胃，正常组、模型组给予等剂量5.0 g/L羧甲基纤维素钠（为滋肾降糖丸溶剂）灌胃。灌胃治疗8周后脱颈处死大鼠[12]。

1.5 生化检测 各组大鼠最后1次灌胃后隔夜禁食12 h，次日清晨采血、离心、取血清。采用ELISA法检测血清β-CTX、OC、骨硬化蛋白、TG、TC和HbAlc含量。血糖检测仪测定空腹血浆葡萄糖（FPG）水平。

1.6 骨密度检测 给药结束后，处死大鼠并分离左侧股骨，应用双能X线骨密度仪及小动物专用软件检测分析BMD。测量参数为双能电压41 kVp和100 kVp，扫描窗宽18 cm，扫描速率4.8 s/cm。

1.7 RNA测序 应用TRizol试剂提取股骨近端的组织总RNA。使用TruSeq小RNA文库制备试剂盒构建小RNA文库。RNA-seq在Illumina HiSeq平台上进行。测序原始数据去接头去冗余后剩余的序列与人类基因组（hg19）比对，并通过miRBase（http：//www.mirbase.org/）用于miRNAs鉴定和注释。

1.8 生物信息学分析 使用Deseq2鉴定差异表达的miRNAs符合差异倍数≥1.5并且错误发现率（FDR）＜0.05标准的miRNAs被鉴定为差异表达的miRNAs。使用KOBAS软件进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes，KEGG）富 集 分析。此外，使用miRanda软件预测miRNAs的mRNA靶标，使用Cytoscape绘制miRNA-mRNA互作网络。

1.9 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR） 使用TRizol试剂提取股骨近端组织的总RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒对分离的总RNA进行定量并进行逆转录分析。使用ChamQ SYBR qPCRMasterMix在TaqMan 7500实时PCR系统上扩增得到的cDNA。采用2-ΔΔct方法计算miRNAs的相对表达（p）。本研究所用引物如表1所示。

1.10 统计方法 应用SPSS 19.0软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（），多组比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用Fisher LSD方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滋肾降糖丸干预对DOP大鼠糖脂代谢和骨代谢的影响 检测各组糖代谢指标FPG、HbA1c、TG、TC，骨吸收标志物β-CTX、骨硬化蛋白，骨形成相关参数OC、BMD。图1结果显示：STZ诱导上调模型大鼠糖脂代谢指标FPG、HbA1c、TG、TC及骨吸收标志物β-CTX、骨硬化蛋白水平，下调骨形成相关参数OC、BMD水平。滋肾降糖丸处理则可抑制STZ诱导的FPG、HbA1c、TG、TC、β-CTX、骨硬化蛋白的上调以及OC、BMD的下调，使之恢复到正常组水平。

2.2 滋肾降糖丸干预对DOP大鼠miRNAs表达的影响RNA-seq测序结果显示：比较正常组和模型组以及模型组和滋肾降糖丸组这2个数据集中有199个共同差异表达的miRNAs（图2-a）。将199个miRNAs中符合模型组较正常组上调同时滋肾降糖丸组较模型组下调，模型组较正常组下调同时滋肾降糖丸组较模型组上调的55个miRNAs在3组样品绘制表达热图（图2-b）。预测这些miRNAs的候选靶基因并对靶基因进行KEGG和GO分析，结果显示miRNAs靶基因主要富集在PI3K-Akt、环磷酸腺苷（cAMP）、FoxO、Rap1、Wnt、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、糖基化终产物—糖基化终产物受体（AGE-RAGE）、细胞循环（cell cycle）等信号通路（图2-c）。GO分析结果发现，miRNAs靶基因参与细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、脂类反应、胰岛素反应、葡萄糖反应等生物学功能过程（图2-d）。

表1 QRT-PCR引物列表Table 1 QRT-PCR primer sequnces

图1 各组糖脂代谢指标、骨吸收标志物、骨形成相关参数比较Figure 1 Comparison ofglucose and lipidmetabolism indexes，bone absorptionmarkers，and bone formation parameters in various groups（）

挑选GO分析图中条目中最多的10个miRNAs进行qRT-PCR验证，结果显示：miR-26a-5p在模型组较正常组上调（P＜0.05），在滋肾降糖丸组下调至正常组水平（P＞0.05）。miR-343、miR-184和miR-295-3p在模型组较正常组下调（P＜0.01），在滋肾降糖丸组上调恢复至正常组水平（P＞0.05）。这4个miRNAs的qPCR结果与测序结果一致。而miR-151-5p、miR-138-5p、miR-196c-5p在3组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。此外，miR-200c-3p在模型组较正常组有上调趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），而其在滋肾降糖丸组较模型组显著下调。miR-200a-5p在模型组较正常组有下调趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），在滋肾降糖丸组较模型组显著上调。miR-547-3p在模型组较正常组显著下调，在滋肾降糖丸组相比模型组无显著性差异（P＞0.05）。结果见图3。

2.3 生物信息学分析滋肾降糖丸处理后差异表达miRNAs功能 使用软件绘制测序和qPCR检测一致的miR-26a-5p，miR-343、miR-184和miR-295-3p与靶mRNA的互作网络。如图4所示，这4个miRNAs的靶基因的功能主要与细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化、胰岛素反应和糖脂反应等有关。

3 讨论

本研究中，我们观察到滋肾降糖丸干预后显著抑制STZ诱导DOP模型大鼠所引起的TG、TC、FPG和HbA1c等糖脂代谢指标和骨吸收参数β-CTX和骨硬化蛋白升高，同时骨形成参数OC和BMD下调。miRNAs表达谱分析显示，一部分在模型组大鼠中差异表达的miRNAs在滋肾降糖丸处理后部分或全部恢复，且功能预测显示这部分miRNAs是与调节糖脂代谢和细胞行为有关的mRNA，提示miRNAs可能参与调节滋肾降糖丸对DOP的保护作用。

图2 滋肾降糖丸干预后DOP大鼠m iRNAs表达特征Figure 2 The characteristics ofm iRNAs expression in DOP rats after ZJP treatment

图3 QRT-PCR验证m iRNAs的表达Figure 3 QRT-PCR verifying the expression ofm iRNAs

图4 R软件绘制m iRNA-m RNA互作网络图Figure 4 MiRNA-mRNA interaction network drawn by R software

骨质疏松与中医理论中“骨萎”“骨枯”等病类似。基于“肾主骨”的传统理论，DOP的病因病机正是由于消渴阴虚内热，燥热耗伤肾阴，久病伤气，肾精匮乏，气虚失摄，肾精虚衰流失，骨失滋养，骨枯髓减，则骨体枯槁，骨质脆弱疏松无力而发为“骨萎”“骨枯”等。治疗上采用滋阴补肾、益精填髓等方法，往往能取得较好的疗效。滋肾降糖丸是本院自行研发的中药复方，具有益气养阴、滋肾壮骨的作用，符合从“肾主骨”理论入手治疗骨质疏松。前期研究证实滋肾降糖丸可通过改善糖代谢、骨代谢异常对DOP产生有益作用，临床研究证实滋肾降糖丸不仅能改善DOP患者中医证候积分以及血钙、血磷等矿物质，对OC、骨保护素（OPG）、β-CTX、骨硬化蛋白等骨代谢相关因子亦有改善作用[11，12]；而细胞实验则证实滋肾降糖丸含药血清能促进BMSCs成骨分化，抑制成脂分化[9，10，13-15]。

HbA1c和FPG是糖尿病筛查的2个重要的葡萄糖代谢标志物[16]。高水平的HbA1c和FPG常与糖尿病相关并发症的纵向风险相关[17-19]。本研究结果显示滋肾降糖丸组中HbA1c和FPG水平较模型组下调，表明滋肾降糖丸可改善糖代谢，从而降低糖尿病相关并发症的发病风险。β-CTX是骨吸收标志物，既往研究表明β-CTX水平高的DM患者骨质流失增加，可作为评估骨质疏松症的生物标志物[20]。骨硬化蛋白是骨形成的负调节因子，几乎完全由骨细胞产生[21]，抑制骨硬化蛋白可逆转骨质流失，同时减少骨质疏松症大鼠模型中的骨吸收[22]。在骨形成过程中由成骨细胞分泌的OC是骨的有机成分之一，其高表达使其成为骨形成的常用生物标志物[23]。BMD是一种骨形成标记，不仅反映了骨量，还反映了骨的矿化程度[24]。本研究中，滋肾降糖丸干预可改善DOP模型大鼠糖脂代谢、抑制骨吸收、促进骨形成，说明滋肾降糖丸在DOP的治疗中可发挥降糖、改善血脂、抗骨质疏松的多靶点作用。

进一步的RNA-seq分析结果显示，STZ诱导可影响大鼠的miRNAs表达，而滋肾降糖丸干预则恢复了部分miRNAs的表达。我们采用qPCR方法验证了滋肾降糖丸干预能恢复STZ诱导的DOP大鼠引起的miR-26a-5p、miR-343、miR-184和miR-295-3p表达水平的变化。其中，miR-26a-5p可作为诱导型一氧化氮合酶的抑制剂，与骨关节炎的发展有关，可能参与调节人体内软骨稳态的维持[25]。在我们的研究中，miR-26a-5p的表达变化及滋肾降糖丸处理后的恢复表明miRNAs在滋肾降糖丸治疗效果中的作用。此外，对这些差异miRNA-mRNA互作网络图谱的分析显示，这些miRNAs的功能与糖脂代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化有关，表明滋肾降糖丸干预所引起的miRNAs表达变化可能与这些功能有关。

综上所述，本研究发现滋肾降糖丸干预可以改善DOP大鼠的糖脂代谢、抑制骨吸收、促进骨形成。同时，STZ诱导的DOP大鼠模型中存在一系列差异表达的miRNAs，这些差异表达的miRNAs主要富集在糖代谢、脂代谢和细胞凋亡有关的通路上，提示miRNAs可能参与滋肾降糖丸治疗对糖脂代谢和骨代谢稳态的保护作用。但由于本研究样本量较小，所得出的结论存在一定的局限性，有待于今后扩大样本量做进一步的探讨。