ERa基因多态性与女性膝骨性关节炎经筋分型及中医证型的相关性研究

易志勇， 韩清民， 郭斯印

（广州中医药大学第三附属医院，广东广州510375）

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种由于关节软骨损伤而引起的韧带、肌腱、膝周关节囊等诸多组织发生病变的一种骨科常见病，其确切发病机制尚未清楚，多发生于老年人群，该病严重影响老年人的生活质量，甚至成为老年人致残的疾患之一[1，2]。目前，随着我国人口老龄化问题的日益严重，KOA发病率逐年上升，这不仅给患者自身带来巨大的痛苦，也给患者家庭和社会带来巨大的经济负担[3]。研究[4]表明，引起KOA发生的主要危险因素有年龄（＞45岁）、性别（女性发病率明显高于男性）、肥胖、遗传因素以及膝关节外伤史或手术史等。近年来，KOA由于其高发病率和高致残率，已引起了国内外学者的广泛关注，同时也进行了大量的临床研究，但由于KOA复杂的发病机制，目前并没有找到更有效的治疗方法。目前，临床上主要采取生物制剂、外科手术治疗和基因治疗3种治疗手段[5，6]。基因治疗是一种新型的KOA治疗手段[7]，该方法可以将生物制品释放到特定靶点进而达到治疗目的，但是由于基因治疗的费用比较昂贵，目前并没有广泛应用于临床治疗中。雌激素受体（estrogen receptor，ER）包括核受体和膜受体，ERa是一种核受体，位于胞浆或胞核内，具有转录因子的作用，可以介导雌激素的基因型效应[8]。ERa可通过与靶基因中的雌激素特异性结合而调节靶基因的转录，从而促进细胞增殖和分化，研究表明，ERa基因单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）可能导致基因在转录、翻译水平失调，导致ER表达、功能异常，从而引起一系列疾病发生。已有研究报道，ERa基因多态性与女性月经过少、乳腺癌以及胃癌的发生密切相关[9，10]。本研究旨在探讨ERa基因多态性与女性KOA经筋分型及中医证型的相关性，以期从基因层面阐述KOA的发病机制，为KOA的临床治疗提供依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年1月至2017年12月在广州中医药大学第三附属医院骨科门诊及住院部就诊且明确诊断为KOA的180例患者作为病例组。患者的平均年龄为55.2岁（45.8～73.7岁），病程最短2年，最长28年，平均11.8年；同时，选取180例同时期在本院体检部门进行体检的正常人群作为健康对照组（简称对照组），所有研究对象均为女性。本研究已获得所有研究对象的知情同意，并符合医学伦理学的各项规定。

1.2 病例选择标准

1.2.1 诊断标准 参照1995年美国风湿病协会修订的KOA诊断分类标准[11]。

1.2.2 纳入标准 ①均经临床确诊为KOA；②年龄在45～75岁之间；③知情并同意参加本研究的患者。

1.2.3 排除标准 ①年龄在45岁以下及75岁以上的患者；②不符合上述KOA诊断标准的患者；③精神病患者；④患有心血管、肝肾等严重疾病的患者；⑤局部有软组织感染的患者；⑥患有骨肿瘤、结核、类风湿性和创伤性关节炎的患者。

1.3 试剂与仪器 全血基因组纯化试剂盒（美国Thermo Fisher公司），iPLEX Gold试剂盒（美国Sequenom公司）；MassArray质谱仪（美国Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 血样采集及DNA提取 采集每位研究对象外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝管中，现场编号并登记姓名，所有标本采集当天送回实验室，置于-70℃冰箱保存，以备DNA提取。采用全血DNA纯化试剂盒进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。

1.5 基因分型 从NCBI和HapMap数据库中查询ERa基因的多态性位点，选择在中国人群（CHB）最小等位基因频率≥5%的位点，最终确定了ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ两个多态性位点作为本研究中的位点。采用Sequenom MassArray SNP基因分型技术对所选择的SNP位点进行分型。qPCR单碱基延伸引物委托上海生工生物工程技术服务公司进行设计和合成，ERa受体序列为P1：5’-CTGCCACC CTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’；P2：5’-T CTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3’。反应在MassArray质谱仪中进行，基因分型使用Sequenom MassArray RS1000软件进行。

1.6 统计方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料用方差分析，计数资料用卡方检验，相关性分析采用Logistic回归分析法。采用精确检验对对照组进行Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验，评估对照组的可靠性。计算各位点的等位基因及基因型频数，采用χ2检验比较两组间各位点的等位基因频率分布差异是否有统计学意义，初步确定检测的位点是否与KOA经筋分型及中医证型有相关性。应用SNPStats在线软件（http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）测定ERa基因的PvuⅡ和XbaⅠ两个多态性位点与KOA经筋分型及中医证型的关系。以相对优势比（odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence intervals，CI）来评估ERa基因的多态性位点与KOA经筋分型及中医证型的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果 经Hardy-Weinberg平衡检验，ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ多态性位点在病例组和对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），说明本研究所选择的样本具有群体代表性。

2.2 ERa基因多态性分布特点 本研究对ERa基因上的两个多态性位点PvuⅡ和XbaⅠ进行基因分型，利用SPSS 21.0统计分析软件进行卡方检验并分析比较各个位点的等位基因频率分布在病例组和对照组中是否具有统计学差异，并对年龄和性别进行校正。结果显示ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性位点的基因型及等位基因频率在病例组与对照组存在明显不同，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1 病例组与对照组ERa基因多态性分布比较Table 1 Com parison of the distribution of ERa genetic polymorphisms between the case group and controlgroup n（p/%）

2.3 ERa基因多态性与KOA发病风险的关联分析ERa基因多态性与KOA发病风险的相关性分析结果显示：在等位基因模型下，PvuⅡ多态性与KOA的患病风险不存在相关性[P等位基因（OR=2.53；95%CI，0.73-1.38；P=0.54），p等位基因（OR=1.36；95%CI，0.35-1.25；P=0.15）]；在等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多态性位点的x等位基因（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035）与KOA的患病风险存在相关性，X等位基因（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.36）与KOA患病风险不存在相关性。此外，本研究还通过卡方检验，比较了基因型频率分布在病例组和对照组中是否具有统计学差异，并对年龄和性别进行校正。结果显示：与参考基因型PP相比，PvuⅡ多态性位点与KOA的患病风险不存在相关性（P＞0.05）；XbaⅠ多态性位点的Xx基因型频率在病例组和对照组中存在显著性差异（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045），说明其能显著增加KOA的患病风险。结果见表2。

表2 ERa基因多态性与KOA发病风险的关联分析Table 2 Correlation analysis of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA n（p/%）

2.4 ERa基因多态性在不同遗传模型下与KOA相关性分析 通过无条件逻辑回归模型，引入3种遗传模型（显性、隐性和加性），分别计算各位点等位基因的OR和95%CI，衡量各位点风险等位基因对KOA风险的效应大小，并按照性别、年龄修正。结果显示：在显性模型下，XbaⅠ多态性位点的最小等位基因X与增加KOA患病风险具有相关性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多态性位点在3种遗传模型下均与KOA的患病风险无相关性（P＞0.05）。结果见表3。

2.5 ERa基因多态性与KOA中医证型的分层分析 根据KOA的中医证型，本研究将180例患者分为寒湿阻络型、湿热阻络型、瘀血阻络型、肝肾两虚型以及混合型5组进行分层，结果显示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性的基因型及等位基因均与KOA的湿热阻络型和混合型这两个证型具有相关性（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表4、表5。

表3 ERa基因多态性在不同遗传模型下与KOA相关性分析Table 3 Correlation of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA in various geneticmodels

表4 ERa基因PvuⅡ多态性与KOA中医证型的分层分析Table 4 Stratified analysis for the correlation of ERa PvuⅡpolymorphism s w ith TCM syndrome types

表5 ERa基因XbaⅠ多态性与KOA中医证型的分层分析Table 5 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ith TCM syndrome types

2.6 ERa基因多态性与KOA经筋分型的分层分析 根据KOA的经筋分型，可以将KOA患者分为足太阳经筋型、足少阳经筋型、足阳明经筋型、足三阴经筋型（足太阴经筋型、足少阴经筋型以及足厥阴经筋型）4种类型。根据KOA的经筋分型对其进行分层，并分析ERa基因多态性与经筋分型的相关性，结果显示：ERa基因PvuⅡ多态性基因型和等位基因与KOA经筋分型无相关性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多态性基因型与KOA经筋分型无相关性（P＞0.05），等位基因x与足阳明经筋型和足三阴经筋型具有相关性（P＜0.01）。结果见表6、表7。

表6 ERa基因PvuⅡ多态性与KOA经筋分型的分层分析Table 6 Stratified analysis for the correlation of ERa PvaⅡpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

表7 ERa基因XbaⅠ多态性与KOA经筋分型的分层分析Table 7 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

3 讨论

膝骨性关节炎（KOA）是引起老年人疼痛和伤残的主要原因之一，严重影响患者的生活质量，给患者家庭带来沉重的经济负担[12]。中老年女性为KOA的多发人群，这可能与女性患者的钙流失严重以及激素水平的变化有一定的关系[13]。ERa基因为一种雌激素受体，可通过与雌激素的结合而引起下游基因的转录。本研究通过病例—对照的研究设计，利用MassArray技术检测了ERa基因的PvuⅡ与XbaⅠ多态性位点，并分析该基因的多态性位点与KOA经筋分型及中医证型的相关性，探讨KOA发病的分子生物学机制，以期为KOA的临床治疗提供科学依据。本次研究中我们所纳入的患者均为女性，这样能更好地解释雌激素水平与KOA发病的相关性。

本研究结果显示：ERa基因XbaⅠ多态性位点的基因型和等位基因频率分布在病例组和对照组有显著性差异，病例组人群等位基因x频率分布明显高于对照组人群，可以显著增加KOA的患病风险（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035），X等位基因与KOA患病风险不存在相关性（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.360）。通过各位点的基因型频率比较发现，与参考基因型PP相比，PvuⅡ多态性位点与KOA的患病风险不存在相关性（P＞0.05）；XbaⅠ多态性位点的Xx基因型频率在病例组和对照组中存在显著性差异，能显著增加KOA的患病风险（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045）。通过无条件逻辑回归模型，我们发现在显性模型下，XbaⅠ多态性位点的最小等位基因X与增加KOA患病风险具有相关性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多态性位点在3种遗传模型下均与KOA的患病风险无相关性（P＞0.05）。

此外，我们还根据KOA的中医证型，对所有女性KOA患者进行了分层分析，结果显示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性的基因型及等位基因均与KOA的湿热阻络型和混合型这2个证型具有相关性（P＜0.05或P＜0.01）。KOA经筋分型的分层分析结果表明，ERa基因PvuⅡ多态性基因型和等位基因与KOA经筋分型无相关性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多态性基因型与KOA经筋分型无相关性（P＞0.05），而等位基因x与足阳明经筋型和足三阴经筋型具有相关性（P＜0.01）。虽然目前还没有研究表明ERa基因多态性与KOA易感性之间的关系，但是我们已从现有研究中发现ERa基因多态性与女性的雌激素水平之间的关系，此外，亦有研究证明ERa基因多态性与乳腺癌之间的关系。因此，在后续的功能试验中我们还会继续增大样本量来进一步验证ERa基因多态性与KOA患病风险之间的关系，以及从功能学方面去研究这些多态性位点与KOA易感性之间的关系。

综上所述，本研究结果表明ERa基因多态性与KOA患病风险之间存在相关性，尤其是ERa基因XbaⅠ多态性位点，表明ERa基因多态性在KOA的发生、发展中可能起着重要的作用，这就为KOA的早期诊断与预防提供了新的候选基因位点，也为该疾病发生机制的研究奠定了基础。基因多态性与疾病发病风险之间的关系是目前国内外关于疾病发病的遗传机制研究比较多的一个方向，也是最能从基因层面上解释疾病发病机制的一种研究方法，该方法可以为疾病的早期预防及临床治疗提供依据[14，15]。但是该研究方法得出的结果往往不是很明确，而且实验结果可能会受到遗传因素和种族差异的影响。此外，研究样本的选择偏倚、不同实验室所用方法的差异等均会造成实验结果的误差，因此，也给该研究方法的使用带来了很多的局限性。虽然本研究发现了ERa基因上与KOA患病风险相关的多态性位点，但是本研究也存在一些缺点，比如样本量相对较少等，因此，在后续的研究中，我们仍然需要进一步在大量人群中去验证这些多态性位点及其与KOA患病风险的相关性；其次，我们没有进行候选SNP位点的功能学研究，所以在后续的研究中我们还需用功能实验来验证候选基因与KOA的相关性；最后，我们仍需要在不同的人群中去验证这些多态性位点，以期为其临床诊断及治疗提供依据。