流感患者TNF-α和IL-10水平以及与病毒载量相关性研究

覃 岭，代艳超，孙坚萍，赵 艳，孙焕芹，张永宏

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，在世界范围内暴发和流行，病死率较高，给社会和人民生活带来严重影响。流感病毒主要分为甲、乙、丙3型，其中甲型流感病毒常发生变异，其典型的临床症状为急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状，秋、冬季节是高发期，引起的并发症和死亡现象非常严重。在流感发生发展中，细胞因子参与机体抗流感病毒免疫应答，发挥免疫调节作用。研究证实，流感患者体内细胞因子会发生一定的变化，但目前关于流感患者体内细胞因子与病毒载量的关系报道甚少[1-3]。故本研究将着重探讨流感患者体内细胞因子分泌水平与流感病毒载量的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2014年11月—2015年3月北京佑安医院急诊科收治的流感患者共36例（流感组）作为研究对象，诊断标准参照《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》[4]及《流行性感冒诊疗方案（2018年版修订版）》[5]。健康对照者为2014—2015年间公开招募的近6个月未患流感的健康大学生志愿者，共 40例（健康组）。排除标准：①严重心、脑、肝及肾等器官性疾病者；②出血性疾病、恶性肿瘤及精神类疾病者。所有入组人员均签署知情同意书。

1.2 标本收集 采集咽拭子标本并置于3 ml保存液的专用采集管，-80 ℃保存；血清样本经不含抗凝剂的真空采血管采集，2200 rpm 离心7 min后，提取，-80 ℃保存。

1.3 仪器和试剂 Bio-Plex细胞因子试剂盒与Luminex技术检测仪器购于美国Bio-Rad公司；甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）购于北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司；RNA提取试剂盒购于德国QIAGEN公司。

1.4 细胞因子检测 按照Bio-Plex细胞因子检测试剂盒说明书检测流感组和健康组血清中TNF-α和IL-10水平。待冻存的血清室温溶解后，按照1︰4的比例稀释血清样本，备用；准备好室温预热30 min的标准品进行倍比稀释，备用；将含有针对多种细胞因子的微球磁珠与空白对照、标准品及稀释后的血清混合，振荡反应30 min；用磁力架去除液体，洗涤液wash buffer洗3 min后，加入检测抗体，混合振荡反应30 min，再用磁力架去除液体，洗涤液wash buffer洗3次，加入1倍稀释的藻红蛋白标记的链霉亲和素，混合振荡反应10 min，用wash buffer洗涤3次。最后加入125 μl的试剂稀释液重悬磁珠，混匀30 s后，通过Luminex检测仪检测细胞因子浓度。

1.5 流感病毒核酸拷贝数测定 从咽拭子中提取流感病毒RNA，-80 ℃保存，经干冰运输，委托北京市疾病预防控制中心对流感病毒RNA拷贝数测定。结果判读如下：在阴阳性对照均成立条件下，CT＜36为阳性；CT≥40或无数值为阴性；36≤CT＜40重新检测，重复检测结果若CT＜36为阳性，否则为阴性。

1.6 统计学处理 应用GraphPad Prism 5软件进行数据分析作图，计数资料采用 χ2检验，2组计量资料采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般临床资料 健康组对照者40例（年龄17～22岁，平均18.9岁），男18例，女22例；流感组患者36例（年龄17～76岁，平均43.5岁），男16例，女20例。流感组患者年龄显著高于健康组对照者（t=7.341，P=0.000），性别构成比上差异无统计学意义（χ2=0.002，P=0.961）。其中流感组患者平均发热天数为2.45 d，体温最高为40.2 ℃，最低为37.7 ℃，平均体温为（38.67±0.10） ℃，且均未用药治疗。本研究中流感组患者的血常规检测值均在正常参考值范围内，见表1。

表1 流感组患者血常规检查结果Table 1 Routine blood examination results of influenza group

2.2 病毒核酸拷贝数测定结果 流感组患者1年内均未接种过流感疫苗，经咽拭子检测，均为甲型流感病毒阳性，提示：所感染的流感病毒亚型为甲型流感病毒；经过流感病毒核酸检测和拷贝数测定，流感组患者的流感病毒载量最大为35 copies/ml，最小为14 copies/ml，平均为（33.57±4.29）copies/ml。

2.3 细胞因子检测结果 流感组患者TNF-α和 IL-10水平分别为（18.18±1.53）pg/ml和（9.64±0.88）pg/ml，均显著高于健康组的（5.03±0.40）pg/ml 和（1.78±0.52）pg/ml，P=0.000，见图1。

2.4 TNF-α和IL-10水平与流感病毒载量相关性分析 流感患者分泌的TNF-α水平与病毒载量相关系数r=0.200，无显著相关性；IL-10水平与病毒载量相关系数r=0.677，呈中等程度正相关，见图2。

3 讨 论

流感是急性呼吸道传染病，其主要特征为传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高等，易出现暴发流行。虽然流感大多为自限性，但仍有一部分患者易出现肺炎等并发症，甚至发展为重症流感，由于病情的进展较快最终可因呼吸窘迫或多脏器衰竭而死亡。在流感发展过程中，细胞因子发挥免疫调节作用，但其是否与流感病毒载量有相关性尚无定论。

本研究纳入36例流感患者和40例健康对照者，对其相应指标进行分析，着重探讨细胞因子水平与流感病毒载量的相关性。结果显示，36例流感患者均处于急性期，TNF-α和IL-10水平均显著高于健康对照者，上述结果与既往文献报道一致[6-7]。此外，Rogo 等[8]和 Martinez-Ocaña 等[9]做了更深入的研究发现TNF-α和IL-10基因多态性对流感病毒有影响。TNF-α是一种促炎因子，过度表达会导致细胞因子风暴，使细胞因子功能失调，打破免疫平衡，从而加重病情。IL-10是一种可以监测感染流感病毒后易患肺炎的一个重要指标[10]，与流感患者病情进展有一定的关系[11]，另外IL-10还是一种抑制性细胞因子，对免疫应答有抑制作用，Yamamura等[12]发现，IL-10可能会抑制机体对流感病毒的清除。而本研究也发现，IL-10水平与流感病毒载量呈正相关（r=0.677），进一步验证了IL-10对流感病毒清除作用的抑制性，提示IL-10分泌量可能是流感患者体内病毒复制的指标之一。

图1 健康组和流感组TNF-α和IL-10水平比较A.2组TNF-α水平； B.2组IL-10水平Figure 1 Comparison of the levels of TNF-α and IL-10 between healthy group and influenza group

图2 流感病毒载量与TNF-α和IL-10水平相关性分析A.TNF-α水平与流感病毒载量相关性分析； B.IL-10水平与流感病毒载量相关性分析Figure 2 Correlation of influenza virus load with levels of TNF-α and IL-10

本研究对TNF-α水平与流感病毒载量相关性进行了分析，结果显示TNF-α水平与病毒载量无显著相关性。TNF-α是一种促炎因子，过度表达会导致细胞因子风暴，使细胞因子功能失调，打破免疫平衡，从而加重病情。但是与流感病毒载量的相关性目前未见报道。

虽然本研究发现了一些有意义的结果，但是也存在一些问题，例如因样本量较小的原因，无法对IL-10和TNF-α的水平是否与年龄有关进行深入探讨。有文献报道，TNF-α在老年人中出现高水平分泌[13]；IL-10在青年人和正常老年人中的水平无显著差异，在有感染的老年人中分泌水平显著增高[14]。而杨蓬勃等[15]研究发现IL-10和TNF-α水平在不同年龄组和不同性别人群中差异均无统计学意义。因此，IL-10和TNF-α的水平与年龄的相关性须要进一步增大样本量加以研究证实。

综上所述，在流感患者中高表达的细胞因子主要是TNF-α与IL-10，且IL-10水平与流感病毒载量呈中等程度正相关，本研究认为IL-10可以作为流感病毒在体内复制的一个潜在的免疫学监测指标。