UPLC-MS/MS法测定鸡肉中氯霉素不确定度的方法

邵栋梁 安徽国科检测科技有限公司 合肥 230051 Anhui Guoke Test Technology Co., Ltd, Hefei 230051

安徽省科技重大专项项目“安徽省地理标志农产品指纹图谱库构建及区块链追溯技术应用研究” 18030701203

氯霉素是一种具有旋光活性的酰胺醇类抗生素，是一种高效广谱的抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用。长期食用氯霉素残留超标的食品可能引起肠道菌群失调，导致消化机能紊乱。人体过量摄入氯霉素可能引起人肝脏和骨髓造血机能的损害，导致再生障碍性贫血和血小板减少、肝损伤等健康危害[1]。因此，联合国粮农组织、世界卫生组织和许多国家限制或禁止氯霉素在畜牧业中使用。我国《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部公告第235号）中规定，在所有食品动物中禁止使用氯霉素。

不确定度是反映检测结果的准确性与可靠性的指标。检验人员通过评定测量不确定度可以进而评价选择的检测方法、找出影响测量结果准确性的主要因素并加以控制，从而提高检测的准确性。本文以鸡肉为例，按照JJF 1059-2012《测量不确定度评定与表示》[2]及国标方法GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》[3]评定鸡肉中氯霉素检测的不确定度，为检测实验室质量控制提供科学、准确的依据，同时为测量其他兽药残留量的不确定度评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

氯霉素（Chloramphenicol）标准溶液和氘代氯霉素（d5-氯霉素）标准溶液（纯度均大于99.2%，德国Dr公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(Agilent 6495)； 电子天平(梅特勒公司，XSE204)，涡旋仪 (IKA公司)； 冷冻离心机(德国贝克曼公司)；超纯水发生器 (Milli Q，密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液和工作溶液的配制

精密称取10.0mg的标准品，用乙腈定容至10 mL，制备成1.0mg/mL的标准溶液储备液。精密移取标准储备液1mL至100mL容量瓶中加入乙腈并准确定容至刻度，得到10mg/L标准溶液中间液，再准确吸取标准中间溶液，加入空白样品中，经前处理后用初始流动相逐级稀释配制成浓度为0.1、0.5、1、2、5μg/L的标准工作溶液。

1.2.2 前处理方法

称取5g（精确到0.01g）测试样品于50 mL离心管中，加入内标溶液，加入15mL乙酸乙酯，0.45 mL氢氧化铵，5 g无水硫酸钠，匀质提取30 s，以4000 r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中。另取一个50mL离心管，加入15mL乙酸乙酯，0.45mL氢氧化铵，洗涤匀质刀头10s，洗涤液移入第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，于液体混匀器上涡旋提取1min，超声波提取5min，以4000 r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管中。残渣再加入15mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并全部上清液至50mL比色管中，用乙酸乙酯定容至50mL。摇匀后移取10mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶中，在45℃旋转浓缩至干。鸡心瓶中的残渣用3mL水溶解，超声5min，加入3 mL正己烷涡旋混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加入3mL正己烷涡旋混合30s，静置分层，移取1mL水相于2mL离心管中，以10000r/min离心5min，过0.22μm滤膜后，供超高效液相色谱—串联质谱测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1×50 mm，1.8μm）； 进 样 量：5μL； 流 速：0.3mL/min；柱温：40 ℃；流动相：A相：0.1%甲酸溶液，B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～1min，维持10%B；1～3min，10% B线性变至60%B；3～5 min，60%B线性变至90%B；5～7min，维持90%B；7～7.1min，线性变至10%B。

1.2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子模式扫描；多反应监测（MRM）；毛细管电压：3000 V；干燥气温度：230℃；干燥气流速：17 L/min；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：12 L/min；喷嘴电压：500 V；雾化气压力：25 psi。主要质谱参数见表1。

表1 氯霉素的主要质谱参数

1.3 数学模型的建立

根据测定方法，采用内标法定量，按下式计算各被测物含量[4]：

式中：X—试样中被测物的残留量，单位为μg/kg；C—样液中被测物的上机测试浓度,单位为μg/L；V—净化液经氮气吹干后的定容体积，单位为mL；实验中V=1mL；m—待测样品质量，单位为 g；

考虑到实验过程中各种随机因素对测量结果的影响，在测量模型中引入重复性系数frep[5]，建立样品中氯霉素残留量不确定度测量模型如下：

由测量模型可看出，影响测定结果不确定度Urel(X)的主要因素有：制备标准储备液引入的不确定度U1(Cs)；向空白基质样品中添加标准溶液引入的不确定度U2(Cs)；标准曲线拟合过程的相对标准不确定度Urel(C0)；净化液经氮气吹干后定容体积引入的不确定度Urel(V)，称量样品引入的不确定度Urel(m)，整个实验重复性（包括提取净化过程和仪器进样） 的不确定度通过Urel(frep)来体现。温度引起的相对标准不确定度很小可忽略不计。

由此得到试样中被测物的残留量的相对标准不确定度Urel(X)可由下式计算：

2 结果

2.1 制备标准储备液引入的相对标准不确定度U1(Cs)

标准储备液的不确定度主要由标准品称量、定容和标准品本身的不确定度决定。

2.2.1 标准品称量引入的相对标准不确定度U11(Cs)

采用分度值为0.0001g的天平，称量10.0 mg的标准品。根据天平检定证书，该天平的全程法定允许误差为±0.0002g，按照均匀分布计算，则天平称量引入的相对标准不确定度为：

2.1.2 标准液定容引入的相对标准不确定度U12(Cs)

100ml容量瓶的定容体积引入的不确定度：试验使用A级容量瓶，其最大允许误差为±0.1ml，按照均匀分布计算，则容量瓶检定引入的不确定度为[6]：

2.1.3 标准品纯度引入的相对标准不确定度U13(Cs)

由供应商（或证书）提供的标准品纯度引入的相对标准不确定度分别为：0.02

制备标准储备液引入的相对标准不确定度由公式计算：

2.2 向空白基质样品中添加标准溶液引入的不确定度U2(Cs)

空白添加标准曲线的制备：准确称取5g（精确到0.01 g）空白试样于50mL离心管内，分别称取5份。分别向其中添加20、100、200、400、1000 μL混合标准工作液（浓度0.01 μg/mL），制得浓度为0.1、0.5、1、2、5 μg/kg的空白添加试料。体积导致的相对标准不确定度的计算方法与3.1（2）是一样的，即向空白基质样品中添加标准溶液引入的不确定度

2.3 标准曲线拟合过程的相对标准不确定度Urel(C0)

添加5个不同浓度的混合标准样品0.1、0.5、1、2、5 μg/kg，按样品处理步骤操作后上机，对应上机浓度0.1、0.5、1、2、5μg/L，每一浓度测定2次。各种化合物以上机浓度C为横坐标，谱图强度峰面积Y为纵坐标，拟合标准曲线，建立数学模型：Yi= bCi+a，计算各化合物线性方程的斜率、截距和相关系数，相关数据见表2。

表2 氯霉素回归直线测量结果表

被测样品2次平行测定后，通过拟合直线求出SR和各化合物浓度C0，根据公式(1)计算出被测样品中所含各待测物残留量X0，按(3)式计算各待测物浓度的标准不确定度U(C0)[7]。

其中Yi―标准溶液的峰面积测定值；Ci―标准溶液的浓度值；b―拟合直线的斜率；a―拟合直线的截距；n―标准溶液测定次数，本实验室中n=10；p―C0测试次数，本实验中p=5；C0―由线性方程计算得各化合物浓度；

拟合曲线导致的相对标准不确定度：

Urel(C0)=U(C0)/C0，有关量值见表3。

表3 浓度C的不确定度计算的有关量值表

2.4 定容体积的相对标准不确定度Urel(V)

用移液器定容至1mL，1000 μL移液器移取两次引入的相对标准不确定度为：

2.5 称量样品的相对标准不确定度Urel(m)

称量样品的天平最大允许误差：±5mg，采用均匀分布

2.6 实验合成重复性的相对标准不确定度Urel(frep)

按实验方法平行测定样品5次，测得样品含量为X1～X5，氯霉素含量的平均值X 测定结果见表4。

表4 重复性相对标准不确定度Urel(frep)计算结果表

标准偏差

参照GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考残留量的测定液相色谱—串联质谱法》对虾肉里的氯霉素含量进行测定，对样品平行测定5次，取包含因子k=2，

相对扩展不确定度：

Urel(X)=2 Urel(X)=0.0908 (k=2, P=95%)[8]

扩展不确定度：

U(X)/(μg/kg) =0.18(k=2, P=95%)

实测值：

X/(μg/kg) = 0.49

鸡肉中氯霉素的含量为：

(0.49±0.18) (μg/kg) (k=2, P=95%)

3 讨论

本研究对UPLC-MS/MS法测定鸡肉中氯霉素的检测结果进行不确定度评定。分析实验过程中不确定度的来源和影响因素，并进行了各分量的评定。实验中鸡肉中氯霉素含量测定结果表述为(0.51±0.18) μg/kg (k=2, P=95%)。通过计算比较发现氯霉素标准溶液配置、标准曲线拟合、检验过程的重复性等引入的不确定度对测定结果不确定度的贡献较大，在今后的实际检测工作中检验工作者应尽可能规范实验操作，减少标准溶液的配制步骤、精确配制标准曲线并加强规范性操作，减少随机误差的产生，以提高检测结果的准确性。