眼后节给药屏障研究进展

陈雪峰,梁丽娜

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）、视网膜色素变性（retinal pigmentosa,RP）、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）等视网膜疾病是常见的致盲性疾病，有报道显示DR 和AMD 的发病率近年来增长迅速[1-2]。药物治疗仍然是上述致盲性眼病的主要治疗方法和研究趋势，主要给药途径包括玻璃体腔注射、静脉给药、视网膜下注射、眼周注射、经结膜给药等，但由于眼内存在复杂的生理和解剖屏障，导致药物很难在视网膜达到有效剂量，从而影响了药物的疗效。近十年人们通过体内及体外实验对眼后节的给药屏障做了大量研究，希望能够找到更有效的给药方法。本文根据不同给药途径综述如下。

1 玻璃体腔注射

玻璃体腔内注射是抗VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体是目前最常用的给药方法之一，其优势表现在可以直接越过数个屏障、操作步骤简单及相对安全。基于这些优势，玻璃体腔注射作为许多新药临床试验的主要给药途径[3]。但药物是否能在视网膜达到有效的治疗剂量仍然取决于是否能通过玻璃体及内界膜屏障[4]。

1.1 玻璃体的屏障作用

来自玻璃体屏障作用包括两个方面：一是玻璃体本身结构形成的静态屏障，二是玻璃体流动过程形成的动态屏障（图1）。

Sakamoto 等[5]发现玻璃体切割术后病毒载体通过玻璃体的作用增强了，提示玻璃体是药物扩散的解剖屏障。非病毒载体的渗透也受到玻璃体凝胶组织的阻碍[4]，研究发现载体所带的电荷对扩散作用有明显影响，比如带负电荷的纳米材料比带正电荷的更容易穿过玻璃体组织[6]。

关于粒子大小对穿透性的影响研究结果不太统一,Xu 等[7]估算牛眼玻璃体的间隙大约在（550±50）nm 左右，并证实了1 μm 大小的颗粒不能顺利通过间隙。但与之相反,Martens 等[8]却发现带负电荷的1 μm 颗粒可以顺利通过相同条件下的间隙。虽然研究结果不一致，但上述研究提示大多数分子及抗体可以通过玻璃体腔，比如用于基因治疗的纳米粒子大小多在10～500 nm 之间，因此玻璃体静态屏障不是影响药物扩散的主要障碍。

玻璃体流动形成的动态屏障对扩散性好的微小药物影响很小，但对于大分子、扩散性差的药物有明显的阻碍作用[9-11]。动态屏障的形成一方面来自于玻璃体前后压力差引起的玻璃体流动，另一方面是由于眼球的运动所引起，后者对药物扩散的影响更难预测，目前的结果大多基于玻璃体替代物研究[12-13]。

1.2 内界膜的屏障作用

现在有很多关于内界膜（internal limiting membranes，ILM）在基因治疗视网膜疾病过程中屏障作用的报道，Dalkara等[14]发现采用蛋白酶对小鼠ILM 进行温和的消化后，腺病毒相关血清转运率明显提高。其他观察也显示与健康的ILM 相比，当ILM 因视网膜疾病遭到破坏时，载体的转导能力得到很大改善[15-16]。在转运过程中，载体通过与ILM 上结合位点的相互作用增加其在玻璃体视网膜界面的累积，进一步扩散到视网膜进行基因表达[14-15,17-19]。Boye 等[19]发现肝素硫酸盐与载体衣壳的结合在此过程中起着至关重要的作用。

ILM 对非载体粒子的屏障作用主要与所带电荷有关，对啮齿类动物来讲，粒子大小的影响并不明显[20]。带负电荷的20 kDa 大小的葡聚糖可以顺利通过ILM[21]，同样大小的带正电的粒子则被ILM 阻挡,即使2000 kDa 大小的带负电粒子也比20 kDa 的带正电粒子更有效地穿透至牛的视网膜中。

2 视网膜下注射

视网膜下注射是将药物注射到感光细胞层和视网膜色素上皮细胞层（retinal pigment epithelium，RPE）之间，注射后会造成150 μm 的间隙，可引起视网膜脱离和视网膜细胞死亡。虽然该治疗方式风险较大，但通过这个方式可直接将治疗药物送至靶组织视网膜，因此，视网膜下注射目前仍然是基因治疗和干细胞治疗的主要手段并有一些成功的报道[22-23]。

视网膜下注射给药几乎克服了眼后节给药的所有屏障，该给药途径的屏障来自视网膜本身[24]。最近，Tao 等[25]通过研究发现内核层和外核层是主要的扩散屏障。除了细胞本身形成的物理屏障阻碍药物扩散外，视网膜内某些细胞成分也可能与治疗药物产生相互作用，这些成分存在于感光细胞的基质中以及RPE 细胞的表面，与治疗药物结合后阻断药物进一步向靶细胞扩散[21]。这可能是视网膜下注射后基因的表达往往局限于视网膜外层和RPE 层的原因[26]。

3 静脉注射

静脉注射是一种应用广泛的临床给药方式，比如静脉滴注激素治疗葡萄膜炎，静脉滴注抗生素治疗眼内炎[27]等，经静脉注射后药物在视网膜上的生物利用度小于5%[28]。因此，静脉注射需要更高的浓度来达到相应的治疗效果，从而增加了副作用的可能性。血-视网膜屏障（blood retinal barrier，BRB）是药物通过血运途径到达视网膜的主要障碍。

BRB 包括内血-视网膜屏障（inner blood retinal barrier，i-BRB）和外血-视网膜屏障（outer blood retinal barrier，oBRB）两部分，iBRB 由muller 细胞间的紧密连接组成，oBRB 由RPE细胞的紧密连接组成（图2）。由于脉络膜毛细血管内皮之间空隙较大，允许像蛋白质这样的大分子物质通过，因此，脉络膜血管层不是药物眼内扩散的障碍。

图1 玻璃体及内界膜示意图。内界膜具有细胞外基质结构，形成间充质细胞的基底膜。玻璃体凝胶是由不同类型胶原纤维网络形成的，网络间充满透明质酸。ILM：内 界 膜；M：muller 细胞端足；G：ganglion 细胞

图2 视网膜和血视网膜屏障（BRB）示意图。NFL：神经纤维层；GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层；PRS：光感受器段；RPE：视网膜色素上皮。1：神经节细胞；2：星形胶质细胞；3：放射状胶质细胞；4：无长突细胞；5：水平细胞；6：双极细胞；7：感光细胞。iBRB 是由视网膜内血管内皮细胞与胶质细胞间的紧密连接形成的。oBRB 由RPE 细胞之间的紧密连接构成

脉络膜-视网膜之间的大分子转移主要受RPE 细胞间的紧密连接影响，连接复合体并不是静态的结构，而是处于打开和关闭交替的动态过程。除外被动扩散通过紧密连接，转运途径还包括借助泵的主动运输以及囊泡的胞吞转运[29]。有报道显示，如果分子足够小（＜0.4 nm）则可以自由通过紧密连接的孔隙扩散，大于0.4 nm 的分子主要通过连接结构的开合来进行扩散[30]。一系列通过离体牛脉络膜-RPE 复合体的研究显示，从20 kDa 到80 kDa 不同大小荧光素标记葡聚糖的通透性随着分子量增大急剧下降[31]。除了大小、分子的亲水性及所带的电荷对通透性也有影响，Pitkänen 等[31]测试了相同大小的β-阻滞剂的通透性,发现亲脂性越强,越能有效地穿过iBRB，亲水性越强则越难通过屏障，oBRB 和i-BRB 这一趋势十分相似[32]。总体来说，小的亲水性物质主要通过细胞间的紧密连接进行扩散，而亲脂性物质主要通过跨细胞的转运途径[31]。另一种屏障作用来自RPE 细胞和iBRB内皮细胞上的P-糖蛋白，这种糖蛋白有着外流泵的作用，可以将药物重新泵回血液，因此，今后的药物研制要考虑如何避免被这种外流泵识别或者与协同应用外流泵抑制剂[33]。对于以纳米微粒为载体的药物来讲，纳米粒的大小对药物的通透性有明显影响。Kim 等[34]给小鼠静脉注射100 nm 和20 nm的金纳米颗粒，仅在视网膜内发现了20 nm 的纳米粒。但有研究显示经抗转铁蛋白受体抗体修饰后，由质粒介导的85 nm 脂质体可以顺利通过BRB 进入视网膜。

4 脉络膜上腔注射

脉络膜上腔（suprachoroidal space，SCS）注射是将药物注射到脉络膜和巩膜之间，在注射的压力下脉络膜和巩膜间会出现缝隙，体积会到达200 μl[35]。脉络膜上腔注射和其他途径一样可以规避许多屏障，比眼前节注射和静脉注射具有更高的生物利用度[36]。

SCS 注射根据靶组织不同药物需要克服的屏障亦不相同，如果治疗视网膜疾病，药物需要通过脉络膜和RPE 层，治疗脉络膜疾病，高脉络膜环流则是药物扩散潜在的主要障碍[3,37-38]。

脉络膜的屏障作用表现在两个方面，一方面作为分子筛限制大分子药物进入，另一方面来自脉络膜丰富的血流对药物的清除作用。既往许多研究已经观察了脉络膜对小分子、大分子以及颗粒的通透性，Tyagi 等[39]发现与眼周注射和玻璃体腔注射相比，通过脉络膜上腔注射氟化钠进入视网膜的速度更快，浓度更高。物质进入眼后节的扩散性依赖于分子量大小，将4 kDa 和40 kDa 荧光标记葡聚糖注射到家兔SCS内，发现视网膜和玻璃体内4 kDa 的葡聚糖浓度明显高于40 kDa[40]，本研究同时观察了不同亲脂力β 阻滞剂在视网膜和玻璃体的分布，发现亲脂性越高分布越多，其机制可能是与结合位点的细胞膜及黑色素亲脂化合物相互作用所致。对于纳米颗粒和大分子来讲，不仅理化性质对其扩散和分布有影响，注射部位也会影响其生物利用度，Chiang 等[41]发现在兔眼后睫状动脉一侧注射的颗粒不能扩散到另外一侧。

与静态屏障相比，脉络膜血流循环形成的动态屏障对药物眼内分布影响更大，目前已有许多相关研究报道[35]。Abarca等[42]采用猪眼体外实验观察证实，经SCS 注射高亲水性药物后，非灌注眼比灌注眼的药物分布要高，但亲脂性药物差异不明显。另有许多研究也发现荧光素标记的不同分子量葡聚糖、贝伐单抗及氟化钠注射后通常在几个小时内很快被清除[35,39,43]，而20 nm～10 um 的非降解颗粒注射后2 个月还可以在脉络膜上腔检测到[43]，上述研究提示纳米及大分子给药系统持续释放可以避免被快速清除，因此具有很大的研究潜力和应用前景。

5 眼周注射

眼周注射用于临床已经很久，包括结膜下注射、球旁注射、球后注射等，侵入性较玻璃体腔注射小，但传统认为通过该途径药物到达视网膜的浓度很低[44]，不但需要克服巩膜、脉络膜、RPE 层等静态屏障，还要克服脉络膜血流和巩膜血流等动态屏障及这些屏障之间相互作用，屏障功能还和药物的性质相关[45]。下面主要讨论巩膜的屏障作用，其他屏障已在前面部分叙述。

巩膜的致密结构形成了药物扩散至眼内的物理屏障，药物能否通过巩膜纤维网状组织很大程度取决于其分子量的大小，分子量越大越难通过，同时大分子物质的清除率也比小分子低得多[45]。药物所带的电荷对其通透性也有一定影响,在生理环境下带负电荷[46]。如果大分子物质带有较多负电荷，则可能由于电荷排斥作用而抑制通透性。仅次于分子量大小和电荷的影响因素是亲脂性，亲脂性物质比亲水性物质更不容易透过巩膜，这可能是由于巩膜水化蛋白多糖的特性决定的[47]。而对于亲水性药物来说其脉络膜生物利用度通常很低，因为大部分药物会在脉络膜的血流中被清除[46]。眼周注射后药物能否成功到达视网膜取决于多种因素之间的平衡，较小的微粒容易穿透各层屏障到达视网膜，但注射后会被迅速清除，大颗粒物质注射后可以较长时间存留，但不容易穿透各层屏障[3,48-49]，因此，目前药物转运方法倾向于采用缓释系统将纳米或微粒物质释放至眼内[3,49]。另外，不同物种间巩膜厚度相差很大，这对巩膜的通透性有直接影响，Nicoli 等[50]发现猪巩膜的厚度是人巩膜厚度的2 倍，人比猪的巩膜通透性要高3 倍，相反，兔子的巩膜厚度只有人的一半，这一点在研究中应予以考虑。

6 经结膜给药

采用滴眼液给药是最方便、安全的眼部给药方式，但由于泪液的稀释、角膜、结膜等眼表的屏障作用、晶体、玻璃体的阻挡作用以及血眼屏障的存在，传统观点认为滴眼剂在眼前部组织中浓度高，但是很难在眼后节尤其是视网膜达到有效的治疗浓度。从理论上来讲，滴眼剂药物到达视网膜的途径有两个：一个是通过角膜途径，另外一个是结膜途径。结膜上皮较角膜具有更高的可渗透性，同时其表面积数倍于角膜，即使是亲水性药物和大分子药物同样可较好地渗透结膜[51-52],目前该途径得到越来越多的关注。OZAKI 等[53]发现钙蛋白酶抑制肽滴眼液可以通过该途径到达视网膜和视神经组织，这一结果提示采用滴眼剂给药方式治疗眼后节疾病的可能。

图3 各给药途径总览

最近有研究眼部滴眼液治疗视网膜疾病的报道。Yamaguchi M 等[54]发现0.8% ripasudil 滴眼液可以明显改善视网膜血流灌注；Vigneswara V 等[55]将相同浓度的色素上皮衍生因子按每天滴眼和每周玻璃体注射进行对比，发现滴眼剂组比玻璃体注射组具有更好的神经节细胞保护作用。因此，虽然是最传统的给药方式，滴眼液在眼底病治疗方面仍有非常好的前景。

7 小结

综上所述，不同给药途径对药物到达眼后节形成不同的生理及物理屏障（图3），除化学药物及生物制剂外，中药制剂亦是亟待开发的宝库,但中药在眼内的有效浓度、在各屏障的通透特点以及如何提高通透率目前所知甚少。因此，加强眼内屏障的研究，寻找更有效的给药方法和给药途径，尤其是加强中药眼用制剂的研究将是我们下一步的努力方向。