甘薯卷叶病毒侵染对叶绿体超微结构的影响

刘仪

摘 要：甘薯是广西广泛种植的农作物之一，但近年来甘薯病毒病普遍发生，对甘薯产量和品质造成了严重影响。本研究已经病毒检测后确定感染甘薯卷叶病毒（Sweet potato leaf curl virus， SPLCV）的甘薯为研究材料，经固定、脱水、包埋和超薄切片过程后，用电镜进行细胞超微结构的观察。研究结果发现感染SPLCV植株的叶细胞有畸形现象出现，细胞壁变薄，叶绿体呈畸形，基粒及基质片层外膜离解模糊，叶绿体肿胀并伴随膜增生，出现嗜锇颗粒等情况。据此推测，甘薯卷叶症状产生的原因可能是由于SPLCV侵染后造成细胞壁变薄，张力变大，细胞支持力变小，从而使叶片容易发生卷曲，最终影响甘薯的产量和品质。

关键词：甘薯;甘薯卷叶病毒;叶绿体;超微结构

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]，旋花科（Convolvulaceae），甘薯属（Ipomoea Genus），长势为平卧在地面往上，叶片通常是圆卵形，长8厘米左右，宽5厘米左右。进入21世纪以来，甘薯在世界范围内粮食生产中总产量排在第五位，是十分重要的粮食作物。

SPLCV是一种双生病毒（geminivirus），属双生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。此病毒侵染后会导致叶片黄化，植株矮缩。2006年，Luan等在国内发现SPLCV。2012-2014年，在多省甘薯种植基地调查发现甘薯卷叶病毒多发。此外，北美和亚洲部分地区也有关于SPLCV发生的报道。

一、实验材料和方法

1.实验材料

遮光处理、严格隔离的供试材料为1（桂紫薯1号）、2（济薯22）、3（桂紫薯3号）、4（桂粉3号（1））、5（桂粉2号）、6（桂粉3号（2））。

（1）主要仪器

冰冻超薄切片机，高速冷冻离心机，NanoDrop 1000C超微量分光光度计，透射电子显微镜，小型常温离心机，PCR仪，水平电泳槽，凝胶成像系统，超净工作台，水浴锅，恒温培养箱，-80℃超低温冰箱。

（2）主要试剂

TRIpure Isolation Reagent（购自Roche公司）;Super RT cDNA第一链合成试剂盒（购自康为世纪公司）;2.5%戊二醛、0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）、1%四氧化锇、乙醇、Spurr低粘度环氧树脂、醋酸双氧铀、柠檬酸铅等。

2.实验方法

甘薯叶片经过叶绿体总RNA的提取（使用TRIpure Reagent 试剂盒提取叶绿体总RNA），甘薯病毒的鉴定RT-PCR（其中包括RNA反转录过程和PCR扩增反应过程），然后进行电镜制样观察 ：分别取健康、具明显症状的叶片，经暗处理，再照光两小时以上。取叶肉部分切成约1mm健康对照的片段，在4℃下用2.5%戊二醛固定过夜，取0.1mol/L的已配制好的磷酸缓冲液（pH=7.0）进行漂洗，用1%四氧化锇固定2 h后，再进行乙醇不同梯度脱水，最后用Spurr低粘度环氧树脂进行包埋。

二、结果

1.供试甘薯样品症状图：

结果分析：从B中可见，叶脉表现出透明网状。从A、D、F中可见，叶片细小，叶片边缘卷曲，叶缘扭曲不齐，叶片小、皱缩。从C、E中可见，症状不明显，但可见粉虱。

2.RNA琼脂糖凝胶电泳结果

用TRIpure Isolation Reagent提取RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，其电泳结果显示：桂粉3号（1）提取的RNA的条带较明亮，浓度较高，其余样品提取的RNA条带比较暗淡，浓度较低。

3.cDNA琼脂糖凝胶电泳结果

将提取出来的RNA用Super RT cDNA第一链合成试剂盒（购自康为世纪公司）合成之后，加入病毒检测引物进行PCR，PCR产物的电泳结果显示：从琼脂糖凝胶电泳图里可以得出桂粉2号、桂粉3号（2）均为单一感染SPLCV。

4.电镜制样观察结果

CH：叶绿体;CW：细胞壁;CM：细胞膜;S：淀粉粒;OG：嗜锇颗粒健康甘薯植株叶片所含叶绿体的超微结构，其形态特征为：细胞壁致密，线粒体、叶绿体轮廓清晰，形态结构完整，分布均匀。健康的叶绿体呈长梭状，排列有序，外膜规整，液泡显著，核染色质均匀，进行着有效的光合作用。

图2中，观察感染SPLCV病毒的甘薯叶片所含叶绿体的形态结构变化。大部分叶细胞的细胞壁变薄，细胞间隙变大变宽，叶片细胞也有不同程度的畸形现象出现。细胞内形态结构发生的变化则主要体现在：基粒及基质片层外膜解体或模糊不清，排列紊乱;叶绿体和线粒体紧密的贴在细胞膜上，细胞质出现空泡化;出现不明代谢物，可能是多糖类物质堆积;叶绿体从原来健康时的梭形胀大堆积变成近圆形，产生了大量的沉积物，淀粉粒增大增多;叶绿体嗜锇颗粒变大、油脂油滴增多;绿体膜增生，部分叶绿体边缘出现异形增生物。

三、讨论

智海剑等和李赤等经研究发现，叶绿体受病毒侵染后，会出现叶绿体嗜锇颗粒变大、油脂油滴增多的现象，特别是衰老和感病的细胞中。李学湛研究受病毒侵染的大豆叶片细胞超微结构，发现病毒会对寄主叶片细胞超微结构产生不良作用，超微结构也会发生不同程度改变。在本研究中，也发现类似现象。甘薯叶片经SPLCV感染后，叶绿体内就出现了大量嗜锇颗粒，影响正常植物的生长。叶绿体受到了结构性的损伤，叶绿体基粒和基质片层模糊并裂解，被SPLCV侵染甘薯叶细胞后细胞膜也发生裂解，且细胞壁变薄，张力变大。

本研究中，还发现SPLCV侵染产生的卷叶症状，使叶绿体从正常的梭状胀大堆积变成近圆形，产生了大量的沉积物，淀粉粒增多;绿体膜增生，部分葉绿体边缘出现异性增生物。而叶绿体等亚细胞结构遭到不同程度的损坏，将直接影响叶片细胞的光合作用，最后影响甘薯的产量和品质。

参考文献：

[1] 毕瑞明. 甘薯（Ipomoea batatas Lam.）的遗传转化及转基因植株的性状变化[D]. 西南大学， 2001.

[2] 智海剑， 盖钧镒， 郭东全， 王延伟. 对大豆花叶病毒不同抗性类型品种的细胞超微结构特征[J]. 南京农业大学学报， 2005， （01）： 6-10.