p16、Ki-67在宫颈鳞状上皮内病变病理诊断中的意义

丁立明 倪良燕 季 丹 孙子恒

宫颈鳞状上皮内病变（SIL）是妇科常见病，是宫颈癌的癌前病变，主要与感染人类乳头状瘤病毒或微生物、吸烟、免疫缺陷等因素有关[1～2]。不同分级的SIL临床表现不同，根据病变程度和发病机制分为LSIL（CIN Ⅰ级）和HSIL（CIN Ⅱ级和CIN Ⅲ级）[3]，LSIL患者缺乏典型临床症状、体征，HSIL患者有白带增多或带血、宫颈糜烂、肥大、息肉等症状、体征，宫颈浸润癌发生概率大。早期明确诊断及其分级对治疗方案的选择、预后评估有重要作用[4]。肿瘤标志物p16、Ki-67 在SIL患者宫颈鳞状上皮组织中呈现不同的表达模式，通过免疫组化单染和双染法可以同时观察p16、Ki-67 表达情况，方法操作简单，精准有效。本文通过观察并总结p16、Ki-67 的表达特征，为SIL的早期诊治提供借鉴经验。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院妇产科2015 年12 月-2018 年6 月宫颈锥切标本56 例，病理诊断均为慢性宫颈炎伴SIL，其中LSIL者21 例（图1a、1b），HSIL者35 例（图2a），部分患者SIL累及腺体（图2b）。患者年龄27～62 岁，中位年龄为45 岁。

1.2 研究方法 标本均用10%中性缓冲福尔马林进行固定，取材、脱水、包埋，3～5μm切片。均行HE染色和p16、Ki-67 免疫组化单染、双染。并经两位高年资病理医师在显微镜下观察分析。免疫组化单染法采用MaxVision二步法，双染法则采用鸡尾酒法，高温高压、pH6.0 柠檬酸修复。一抗：Ki-67（即用型鼠抗体，克隆号：MIB-1）、p16（即用型鼠抗体，克隆号：6H12），DAB显色，苏木素复染。每批均设阳性对照和阴性对照。以上试剂均购自福州迈新生物科技有限公司。

1.3 判定标准

1.3.1 p16及Ki-67在IHC单染中的着色特征 p16在鳞状上皮细胞核/质中表达，Ki-67 在鳞状上皮细胞核中表达，两者阳性信号均为棕黄色。

1.3.2 p16及Ki-67在IHC双染中的着色特征 p16阳性信号呈红色，Ki-67 阳性信号呈棕黄色。

1.3.3 IHC单染及双染法中p16 及Ki-67 阳性表达判定标准[5]①p16 判断标准：p16 在切片中阳性表达范围＜30%时为弱阳性（+），在30%～50%时为阳性（++），＞50%时为强阳性（+++），不着色为阴性（-）。②Ki-67 计数方法：高倍镜下随机选取10 个不重复视野，每个视野中计数50个细胞，求平均值作为Ki-67 阳性细胞百分数。在分类变量中，Ki-67 按照表达部位分为0-3 共4级，0 级：阳性信号在基底膜上方1-3 层；1 级：阳性信号在鳞状上皮细胞下1/3 层（超过0 级标准）；2 级：阳性信号在鳞状上皮细胞中下2/3 层（超过1 级标准）；3 级：阳性信号超过鳞状上皮细胞中下2/3 层。Ki-67 呈0 级者定为阴性，1-3 级者定为阳性。IHC单染与双染法中，p16 与Ki-67 的判读标准一致。

1.4 统计学方法 本次研究采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据，计数资料采用百分率比（%）表示，指标间差异采用卡方（χ2）检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 p16 免疫组化单染结果 21 例LSIL中6 例呈阴性，11 例呈弱阳性（图1c），3 例呈阳性，1 例呈强阳性；35 例HSIL中弱阳性7 例，阳性10 例，强阳性18 例（图2c）。p16 在LSIL与HSIL组织中表达方式与表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 低级别宫颈鳞状上皮内病变（LSIL）组织学改变和免疫标记特征

图2 高级别宫颈鳞状上皮内病变（HSIL）组织学改变和免疫标记特征

2.2 Ki-67 免疫组化单染结果 正常情况下Ki-67 基底层细胞阳性，表达为0 级，Ki-67 阳性细胞随着SIL分级升高明显增多，在LSIL组织中，Ki-67 主要表达于鳞状上皮层的下1/3（图1d）；而在HSIL组织中其可分布于鳞状上皮的中下2/3甚至全层（图2d）。21 例LSIL级患者中0 级4 例，1 级17 例；35 例HSIL患者中0 级0 例，1 级3 例，2 级12 例，3 级20 例。Ki-67 在LSIL和HSIL中 的 表 达方式和表达水平不同，在HSIL中表达水平较LSIL高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 p16和Ki-67在宫颈鳞状上皮内病变中的表达比较（例）

2.3 双染结果 p16、Ki-67 阳性率双染结果与单染具有一致性，双染不会使指标染色信号损失。SIL级别越高，p16、Ki-67 阳性表达率越高，p16 和Ki-67 共表达的例数逐渐增多。

3 讨 论

SIL是女性常见宫颈病变，人乳头瘤病毒（HPV）会加速鳞状上皮增生速度，促使其向宫颈鳞状细胞癌转化，威胁患者生命安全[6]。本研究中56 例SIL患者中41 例高危型HPVDNA检测呈阳性。p16 基因参与细胞代谢过程，其产物p16 蛋白对细胞周期素依赖性激酶有明显抑制作用，对细胞分裂、增殖有负调节作用。当人体感染HPV时使p16 高度表达，且长期研究证实，p16 蛋白阳性率在LSIL、HSIL中呈持续上升趋势，与SIL病变程度呈正比。Ki-67 属于增殖细胞核抗原，与细胞周期密切相关，主要在基底层细胞及周围细胞中表达，反映肿瘤细胞活性。Ki-67 呈高度表达状态提示病变恶性度高、侵袭性强，预后较差。通过免疫组织化学染色检测Ki-67、p16 在SIL上表达情况对其诊断、分级具有重要鉴别作用而HSIL容易形成宫颈鳞状细胞浸润癌，治疗难度大，威胁患者生命安全[4]。早期明确诊断，了解患者病理分级并及时治疗可以阻止病情进展。

免疫组化单染法、双染法可以检出p16、Ki-67 在SIL患者中的表达情况，判定病变在SIL分层情况[5]。通过对56 例标本进行观察发现，p16、Ki-67 在免疫组化染色两种方法中的表达具有一致性，且SIL分级越高，p16、Ki-67 阳性表达率越高，HSIL级患者p16 阳性率为100%，同时LSIL与HSIL关于p16 的表达模式亦有不同，前者呈弥漫强阳性，而后者呈局灶不连续的弱阳性。p16 阳性率越高，Ki-67 在上皮表层或中层细胞核中着色提示患者病变程度越严重。p16、Ki-67 可以反映SIL患者病变程度，对患者进行病程程度分级，预测患者预后情况。

相对于组织形态学，免疫组化染色可以更加有效地区分病变类型及分级情况。HSIL较LSIL而言，p16、Ki-67 阳性率更高。而相对于单染法，双染法定位特异性强，更加准确，从而更加精准地进行SIL的病理诊断及分期，并指导临床选择最佳治疗方法。