在线热脱附-GC/MS 法检测人体尿液中烟碱及可替宁

汪阳忠，李 钢，陶立奇，吴 达，刘百战

上海烟草集团有限责任公司技术中心，上海市杨浦区长阳路717 号 200082

烟碱及可替宁是常用的重要卷烟烟气暴露标志物［1-3］。准确分析吸烟者体液或组织中的烟碱及可替宁含量对完善卷烟风险评估技术非常重要［4-5］。吸烟者尿液中的烟碱及可替宁相较于血液来说取样更为方便，因此，尿液是卷烟暴露标志物研究中主要关注的生物基质。目前检测烟碱及可替宁的分析方法主要有LC-MS/MS［6-8］及GC/MS［9-11］。在检测尿液时，一般利用市售固相富集（SPE）小柱进行样品前处理，但上样及洗脱步骤操作较繁琐，过程耗时较长，不利于样品的批量分析。SBA-15 介孔材料具有比表面积高、主孔道尺寸均一、孔壁厚、水热稳定性较好等特点，自首次合成以来一直受到广泛关注，在催化、吸附和分离、生物及纳米材料等领域具有潜在应用前景［12-16］。

本研究中选择孔径在6～50 nm 范围内可以调变的SBA-15 介孔材料，在不同温度下对其进行100%水蒸气焙烧改性，并将其作为烟碱及可替宁的固相富集材料；通过考察改性材料吸附性能及结构剖析，明确改性SBA-15 介孔材料对烟碱及可替宁的吸附规律；在此基础上，研究建立集吸附、热脱附、进样、分析为一体的样品在线分析联用装置，并建立相应的在线热脱附-GC/MS 方法，旨在为快速、在线检测大批量吸烟者尿液样品中的烟碱及可替宁提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

SBA-15 介孔材料（由上海市绿色化学与化工过程绿色化重点实验室提供）。

烟碱、可替宁均为标准品（美国Cerilliant 公司）；二苯胺［17］（美国Sigma-Aldrich 公司）、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；实验用水为二次去离子水；新鲜的吸烟和非吸烟志愿者尿液，收集后于4 ℃冰箱密封保存，24 h 内进行实验。

7890-5977 气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）；烟碱及可替宁的在线富集及进样系统为自主搭建，其中六通阀最高使用温度350 ℃（美国Valco 公司），另外包括卡头、球阀不锈钢管线等材料（美国Swagelok 公司）；XP404S 电子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Ultima Ⅳ型X射线粉末衍射仪（配D-tex 检测器，日本Rigaku 公司）；Auto 3B 型N2吸附比表面积测定仪（美国Quantachrome 公司）；SEM-4800 型高分辨扫描电镜（日本Hitachi 公司）；DSX 300 型核磁共振波谱仪（美国Varian 公司）。

1.2 方法

1.2.1 改性SBA-15 介孔材料的合成与表征

按照文献［18］的方法合成SBA-15 介孔材料，于550 ℃焙烧6 h 以去除模板剂；将新制备的SBA-15 样品置于50 mL 蜂窝陶瓷杯中，在四段加热管式炉中进行100%水蒸气焙烧（以下简称水焙）6 h，水流速为4 mL/min，选用400、500、600、700、800 ℃5 个水焙温度，水焙处理后的SBA-15即为改性SBA-15。

使用X 射线粉末衍射仪对材料进行XRD 表征：光源CuKα，2θ角0.5～5°，扫描步长0.01°，扫描速度1°/min，电压35 kV，电流25 mA；使用N2吸附比表面积测定仪对材料进行比表面积及孔隙度测试；使用高分辨扫描电镜获得材料的电子扫描照片；使用核磁共振波谱仪获得材料的Si29固体核磁图谱。

1.2.2 标准工作溶液的配制

准确称取烟碱及可替宁各10 mg，于10 mL 容量瓶中用甲醇定容；准确移取上述溶液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成标准品储备液。内标二苯胺配制在甲醇溶液中，质量浓度为500 ng/mL，所有标准溶液均于4 ℃冷藏保存。分别准确移取10 μg/mL 的储备液0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、20.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，配制成不同浓度的标准工作溶液，其中内标的质量浓度为5 ng/mL。

1.2.3 样品处理与分析

取尿液0.99 mL，加入10 μL 内标溶液，振荡离心后取上清液10 μL 直接进样分析。GC/MS 分析条件为：

色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样量：10 μL；进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气；流速：1 mL/min；升温程序：初始温度为140 ℃，保持1 min 后以5 ℃/min 升到160 ℃，保持1 min 后再以30 ℃/min 升到230 ℃，保持1 min；接口温度：250 ℃；分析时间为30 min；分流比：3∶1；离子源：EI 源；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；检测方式：选择离子扫描，选用的烟碱及可替宁的定量离子（m/z）分别为84 和98。

标样及尿液中烟碱及可替宁的在线富集及检测在图1 所示的装置中进行。将100.0 mg SBA-15介孔材料装填于外径6 mm、内径4 mm 的不锈钢管A 中，在两端装填适量去活化玻璃纤维，按示意图连接装置。设置辅助气流速50 mL/min，恒温杯D 温度120 ℃，三通球阀C 为Vent 状态；从进料口B 注射标液或待检样品10 μL，辅助气吹扫2 min后，同时切换三通球阀C 和六通阀E 至色谱进样状态；将恒温杯升至250 ℃，启动GC/MS 程序进行样品分析。

图1 自动化在线热脱附-气相色谱/质谱联用系统原理图Fig.1 Principle diagram of automatic thermal desorption-GC/MS system

2 结果与讨论

2.1 烟碱及可替宁在改性前后SBA-15 上的吸脱附情况

按照1.2.3 节的气相色谱质谱联用条件对烟碱及可替宁进行检测，结果如图2 所示。可以看出，烟碱与可替宁的保留时间分别是4.59 和8.56 min。

图2 烟碱及可替宁的TIC 图Fig.2 TIC chromatogram of nicotine and cotinine

选用烟碱质量浓度为2 000 ng/mL 的标准溶液，在自主搭建的在线装置上，考察400、500、600、700、800 ℃下水焙前后的SBA-15 介孔材料对烟碱的吸附-热脱附情况，结果如表1 所示。由表1 可知，在未改性SBA-15 介孔材料上，烟碱的检出率（即绝对回收率，定义为实际检出量与理论检出量的百分比值，为与相对回收率区分，在此处以检出率表示）仅为0.50%，说明未改性SBA-15 几乎无法吸附烟碱。当SBA-15 用100%水蒸气焙烧处理后，烟碱的检出率随水焙温度的升高而显著增加。当水焙温度为700 ℃时，烟碱的检出率最高，为78.62%，表明该改性材料对烟碱有较好的富集效果。当水焙温度高于700 ℃时，烟碱的检出率降至44.62%，表明该改性材料对烟碱的富集效率较差。分析可知，烟碱检出率的变化可能与SBA-15 在水焙过程中微观结构发生改变有关。

表1 烟碱在改性SBA-15 上的脱附情况①Tab.1 Desorption result of nicotine on modified SBA-15

在相同条件下，可替宁的检测结果如表2 所示。可以看出，未改性SBA-15 介孔材料无法吸附可替宁（可替宁未检出）。当SBA-15 用100%水蒸气焙烧处理后，可替宁检出率随水焙温度的升高显著增大。当水焙温度为700 ℃时，可替宁检出率最高，为62.62%，表明该改性材料对可替宁的富集效果最佳。当水焙温度高于700 ℃时，可替宁的检出率降至36.62%。

表2 可替宁在改性SBA-15 上的脱附情况Tab.2 Desorption result of cotinine on modified SBA-15

综上可知，水焙改性后的SBA-15 介孔材料可有效吸附烟碱与可替宁，且以700 ℃时100%水焙改性SBA-15 介孔材料的富集效率最高。

2.2 改性前后SBA-15 的结构剖析

2.2.1 晶体衍射分析

图3 不同改性温度下的SBA-15 的XRD 谱Fig.3 XRD spectra of SBA-15 modified at different temperatures

剖析SBA-15 介孔材料尤其是700 ℃水焙改性SBA-15 介孔材料的结构特征是揭示材料高效吸脱附烟碱及可替宁的关键。图3 是水焙改性前后SBA-15 的XRD 谱。可以看出：未改性SBA-15 具有典型的六方介孔结构特征；400 ℃水焙后的SBA-15 的衍射峰强度显著增强，2θ角略向大角发生移动，表明400 ℃水焙改性增强了SBA-15 的介孔结构；随着水焙温度从400 ℃升至700 ℃，SBA-15 的衍射峰强度略呈下降趋势但其仍具有典型的六方介孔结构特征；当水焙温度为800 ℃时，SBA-15 的衍射峰强度进一步减弱，尤其110 和200 两个晶面衍射峰弥散，表明800 ℃水焙改性后的SBA-15 的介孔结构发生了部分塌陷。结合烟碱及可替宁的吸脱附情况可知，在700 ℃及以下温度下进行SBA-15 的水焙改性可以增强其介孔结构，从而有利于烟碱及可替宁在SBA-15 上的吸脱附。

2.2.2 脱附性能分析

高温水焙改性SBA-15 除具备常温下吸附烟碱及可替宁的能力外，还具备高温下能迅速脱附烟碱及可替宁的性质。图4 是水焙前后SBA-15 的N2物理吸附特性。图4a 为吸附等温线，未改性SBA-15 具有明显的介孔特征滞后环，随着水焙温度的升高其滞后环逐渐向左移动，表明水焙改性导致SBA-15 晶胞收缩。从SBA-15 的孔径分布图（图4c）可知，未改性SBA-15 和400 ℃水焙改性SBA-15 的最大孔径为5.5 nm，随着水焙温度的升高，其最大孔径降至4.8 nm，而800 ℃水焙样品的最大孔径降至3.5 nm，其强度也明显减弱，表明其结构被明显破坏，这与XRD 的表征结果一致。t-plot 曲线（图4b）显示，未改性SBA-15 的微孔体积为0.082 2 cm3/g，随着水焙温度的增加，SBA-15的微孔体积呈明显下降趋势，700 ℃水焙SBA-15的微孔体积仅为0.0317 cm3/g，为改性前SBA-15 的38.6%，800 ℃水焙SBA-15 的微孔体积进一步降至0.025 8 cm3/g。

图4 水蒸气焙烧前后SBA-15 的N2物理吸附情况Fig.4 Physical adsorption of SBA-15 to N2 before and after steam roasting

通常有机物在分子筛上的吸附行为主要发生在微孔和介孔孔道表面，微孔的孔道主要在1 nm以下，与有机分子的尺寸相差不大。有机分子吸附在这些微孔中难以脱附。介孔的孔道在2～50 nm，这些孔道远远超过了一般有机分子的尺寸，因此吸附在介孔孔道内的分子较容易脱附。尽管SBA-15为介孔分子筛，但在未改性SBA-15 中仍存在少量微孔结构，这些微孔主要存在于介孔的孔口处，导致吸附的有机分子不能自由地进出介孔孔道。烟碱、可替宁分子被SBA-15 介孔孔道吸附后，即使在较高温度下也不能及时脱附，这是烟碱、可替宁在未改性SBA-15 上的检出率较低的根本原因。

高温下水蒸气改性SBA-15 可使其微孔数量明显减少，由于改性处理解决了SBA-15 介孔孔口的瓶颈问题，使有机分子在低温下可以顺利地进入介孔孔道，而在高温下又能从介孔孔道中脱附，因此明显提高了烟碱及可替宁的检出率。但是，800 ℃水焙SBA-15 的介孔结构破坏严重，其吸脱附烟碱及可替宁的能力明显下降。综上可知，700 ℃是SBA-15 改性的最佳水焙温度。

2.2.3 扫描电镜及固体核磁分析

SEM 图（图5）显示，在未改性SBA-15 样品表面上存在大量10～300 nm 不规则无孔硅纳米粒子，改性后（如700 ℃下水焙后）绝大多数无孔硅纳米粒子消失，表面变得较规整。这些表面硅纳米粒子可能参与了SBA-15 内壁去除微孔的过程，从而提高了SBA-15 吸附脱附烟碱及可替宁的能力。29Si 的固体核磁表征结果也证实了水焙改性后SBA-15 微孔数量的减少。如图6 所示，700 ℃水焙后，Q4的含量从74.2%增至84.7%。

图5 水蒸气焙烧前后SBA-15 的SEM 照片Fig.5 SEM pictures of SBA-15 before and after steam roasting

图6 水蒸气焙烧前后SBA-15 的29Si 固体NMR 谱Fig.6 29Si solid state NMR spectra of SBA-15 before and after steam roasting

2.3 方法学考察及样品分析

采用700 ℃水焙6 h 后改性SBA-15 介孔材料为吸脱附剂，在线分析烟碱及可替宁。将配制的系列标准工作液从低到高依次进样，建立回归方程，其R2分别为0.999 8 到0.999 7，表明工作曲线的线性关系良好。以3 倍信噪比（3 S/N）时的进样浓度为检测限（LOD），结果表明，烟碱及可替宁的检测限分别为0.5 和0.4 ng/mL。在经过处理的空白尿液样本中加入低、中、高3 个水平的烟碱及可替宁。加入量分别为10、100、200 ng，每个水平重复6 次。分别计算回收率与相对标准偏差（RSD）。结果表明，方法平均回收率为97.28%～104.55%，RSD 为0.25%～3.18%（表3）。可见，本方法结果准确，可以满足定量分析要求。

采用本方法对吸烟及非吸烟志愿者尿液中的烟碱及可替宁进行了测定，结果表明，非吸烟者尿液中烟碱与可替宁含量均小于5 ng/mL，而吸烟者尿液中烟碱与可替宁含量分别为259～1 315 和119～532 ng/mL，与文献［6，19］报道的检测结果相当。

3 结论

以水蒸气焙烧改性后的SBA-15 为固相富集材料，通过结构剖析阐明了改性SBA-15 介孔材料对烟碱及可替宁的吸脱附性能。自主设计了一种集吸附、热脱附、进样、分析为一体的实验装置，并基于该装置建立了一种分析吸烟者尿液中烟碱及可替宁含量的在线热脱附-GC/MS 方法。700 ℃下水蒸气焙烧6 h 的SBA-15 的烟碱及可替宁热脱附能力较强。烟碱及可替宁在1～2 000 ng/mL 范围内工作曲线的线性较好（R2≥0.999 5），方法回收率为97.28%～104.55%，RSD 为0.25%～3.18%，检测限分别为0.5 和0.4 ng/mL。该方法无须使用溶剂洗脱，便捷、高效、快速，适用于吸烟者尿液中烟碱及可替宁的在线分析。