土壤中20种磺酰脲类除草剂的超高效液相色谱-串联质谱测定方法

赵 彬，张付海，张 敏，王 昭，丁 磊

1.安徽省环境监测中心站，安徽 合肥 230071 2.合肥海关技术中心，安徽 合肥 230032

磺酰脲类除草剂是目前使用最广泛的一类除草剂，为弱酸性物质，在土壤中的淋溶和降解速度受土壤pH影响较大[1-3]。其淋溶性随着土壤pH的增加而增加；在酸性土壤中，降解速度快，在碱性土壤中降解速度慢。该类除草剂大约包含20多种化合物，由于具有高效、低毒等优点，广泛应用于农业生产。但在其使用过程中已遇到一些突出问题：该类除草剂不易挥发、不易光解，在农作物中长期残留；随着雨水的冲刷，在土壤、沉积物和水体中也存在一定残留，且随土壤pH上升，半衰期延长，造成对自然环境污染。近些年来磺酰脲类除草剂在农作物中的残留、对环境的污染及对人类健康造成的危害越来越被人类所重视。随着我国新的保护土壤环境质量、管控土壤环境风险的《国家土壤环境质量标准》[4-5]的颁布与实施，建立起这类除草剂的快速、准确、有效的风险预警监测方法就显得尤为重要。

目前针对该类除草剂的残留检测方法主要有化学分析法、酶联免疫法、生物测定法、毛细管电泳法以及色谱-质谱联用技术[6-17]。化学法和酶联免疫法虽然操作简便、检测快速，但遇到假阳性样品则不能准确判断，需要质谱进一步确认。

生物法、毛细管电泳法以及单一色谱法，针对复杂基质的环境样品，不能很好确证，受基质杂质干扰较大。而HPLC-MS/MS技术因具有高选择性、高灵敏度及快速准确定量等优点得到广泛应用，是环境样品等复杂基质样品检测、定性定量的优选方法。针对土壤样品的前处理方法目前有超声振荡提取、QuEChERS法净化、固相萃取小柱法(SPE)净化等[6-11]，而关于加速溶剂萃取法(ASE)提取、凝胶渗透色谱法(GPC)尚未见到有关研究。由于环境土壤样品基质复杂，有腐殖酸、色素、动物脂肪、微生物、蛋白质等强干扰物质存在，QuEChERS法和固相萃取小柱法的净化效果较差，导致基质效应较强，并且无法同时满足多种磺酰脲类除草剂的残留检测，不能取得较为理想的回收率。而针对上述土壤基质，凝胶渗透色谱法则能很好解决。而加速溶剂萃取法的提取效率明显要高于普通的超声振荡提取法，并且其具有仪器操作化程度高、样品重现性好等特点。

综上所述，本文在参考相关国家残留限量标准和磺酰脲类除草剂使用现状情况下，选择了烟嘧磺隆、甲酰胺磺隆、环氧嘧磺隆、甲基噻吩磺隆、甲磺隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆、四唑嘧磺隆、甲磺胺磺隆、三氟啶磺隆、丙苯磺隆、氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、环丙嘧磺隆等20种磺酰脲类除草剂作为研究对象，建立了农用地土壤中20种磺酰脲类除草剂残留量的加速溶剂提取、凝胶渗透色谱法净化、UPLC-MS/MS定性定量的方法。方法检出限为2～5 ng/kg，并应用本方法对中部某省农用地土壤详查样品进行了监测分析。结果显示，不同程度检出了该类除草剂。该方法能有效、灵敏、准确地对农用地土壤中磺酰脲类除草剂监测检测。

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

真空冷冻干燥机(LGJ-25，北京四环科学仪器)；台式鄂式破碎仪(JC6，北京格瑞德曼)；超高效液相色谱/串联质谱Waters TQ-S(Waters公司，美国)；定量平行浓缩仪(MultiVap-8，北京莱伯泰科)；加速溶剂萃取仪(ASE350 Thermo SCIEIVTIFIC，美国)；凝胶渗透色谱仪(GPC ultra，LC Tech®，德国)；超纯水制备仪(Millipore Milli-Q Integral15，美国)；Waters BEH C18色谱柱,50 mm×2.1 mm×1.7 μm。

20种磺酰脲类除草剂标准品购于瑞士，SIGMA公司，纯度≥99.9%。丙酮、甲酸、甲醇、乙腈(农残级，Merk公司)；超纯水；0.22 μm有机滤头(尼龙)。

1.2 样品的采集与制备

采集2 kg新鲜土壤样品于棕色广口玻璃瓶中，在4 ℃冷藏保存。样品经真空冷冻干燥(-40 ℃，5 Pa，12 h)后，研磨粉碎过0.24 mm孔径筛。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的提取

加速溶剂仪提取：准确称取20.00 g制备好的样品于66 mL萃取小池中，用丙酮与乙腈体积比4∶1的溶液，于100 ℃静置萃取5 min。循环提取2次，然后用氮气吹扫30 s整个管路，收集提取液，于40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，用10 mL乙酸乙酯与环己烷体积比1∶1溶液溶解，待净化。

1.3.2 样品的净化

凝胶渗透色谱仪净化过程：取上述提取液进凝胶色谱系统。净化柱：S-X3 Bio-Beads填料，粒径38～75 μm,300 mm×10 mm(内径)，流速5 mL/min，淋洗液为乙酸乙酯-环己烷体积比1∶1；弃去0～14 min淋洗液，收集14～27 min淋洗液。将收集的洗脱液于40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，准确用初始流动相定容至1 mL，经0.22 μm有机滤头(尼龙)过滤后，待高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 色谱质谱条件

超高效液相色谱条件：色谱分离采用线性梯度洗脱。流动相A为乙腈，流动相B为超纯水-0.1%甲酸。采用线性梯度洗脱条件，见表1。 进样量为 10 μL，流速0.4 mL/min，样品室温度10 ℃；色谱柱温：40 ℃。

表1 液相色谱线性梯度洗脱条件Table 1 Linear gradient elution conditions of liquid chromatography

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式进行检测，监测模式为多级反应监测模式(MRM)。喷射电压1.5 K，源温度为200 ℃，脱溶剂气温度为400 ℃，流量为850 L/h，锥孔气流速为150 L/h，锥孔电压和碰撞能经实验优化见表2。

表2 20种磺酰脲类除草剂英文名称、CAS号、监测离子对和碰撞能量Table 2 The English name, CAS number, ion pair monitoring and collision energy of 20 sulfonylurea herbicides

注：“*”表示定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 样品前处理方法的优化选择

目前关于环境土壤样品的前处理方式，大都采用风干干燥的方法，但是由于其需要大量时间而可能导致目标物的降解损失。因此我们选择了相对快速的真空冷冻干燥法，可以快速对土壤进行干燥。对于干燥研磨好后的样品，目前提取方法大多为液-液萃取、超声萃取、加速溶剂萃取(ASE)等方法。考虑到快速简便提高萃取效率，我们尝试选用了加速溶剂萃取(ASE)的提取方式，提取效率较文献[5-11]中提到的超声提取法提高了12%～25%。

2.1.2 提取溶剂的优化选择

由于土壤样品基体复杂，基质成分与目标化合物的含量相差悬殊，同时在进行药物多残留分析过程中，由于所分析的目标化合物的物理化学性质存在较大差别，选择合适的萃取溶剂对获得多种化合物满意的回收率、最大程度降低共萃取的基体杂质成分至关重要。为了减弱磺酰脲类质与土壤基质之间相互作用，本文比较丙酮、甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲液等溶剂的提取效果，实验结果显示：甲醇、乙腈或甲醇乙腈混合溶剂提取时氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、环丙嘧磺隆这7种目标物的回收率较低(只有45～70%)，其他目标物回收率在70%以上。而丙酮与乙腈体积比4∶1的溶液作为提取溶剂，20种磺酰脲类除草剂回收率为75%～110%。不同提取溶剂的磺酰脲类除草剂提取效果见图1。最终选择丙酮与乙腈体积比4∶1的溶液作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂的磺酰脲类除草剂回收率Fig.1 Recovery rates of sulfonylurea herbicides from different extraction solvents

2.1.3 净化方法的优化选择

土壤样品基体复杂，在上述提取条件下得到的样品溶液中，含有基体干扰杂质，尤其是含有大量的色素、有机腐殖酸、微生物动物腐殖蛋白等干扰，对液相色谱的进样系统、色谱柱以及质谱的离子源等部件都会造成一定的污染，使其使用性能下降。如何对样品提取液进行净化，在保证回收率的前提下，获得较高的基体净化度，尽可能去除杂质干扰，就成为分析方法的关键问题。

目前文献报道磺酰脲类除草剂净化方法有QuEChERS法、固相萃取(C18、HLB、ENVI-CARB)等。QuEChERS法分别比较了4种不同填料配比萃取管：第1种MgSO4150 mg、PSA 50 mg、C1850 mg；第2种MgSO4150 mg、PSA 25 mg、C1825 mg；第3种MgSO4150 mg、PSA 25 mg；第4种MgSO4150 mg、PSA 50 mg。实验结果显示，氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、环丙嘧磺隆这几种物质的回收率较差，只有20%～40%，部分磺酰脲的回收率达到150%以上，这主要因为土壤基质效应较强。同样3种固相萃取柱(C18、HLB、ENVI-CARB)回收率无法同时满足20种磺酰脲类除草剂的残留检测。

最终本实验选择了针对土壤、沉积物基质干扰物质(色素、有机腐殖酸、微生物、动物腐殖蛋白等)能有效去除的凝胶渗透色谱法(GPC)作为净化条件。使用该方法检测20种磺酰脲类除草剂的残留量的回收率为70%～120%，优于相关文献净化条件。因为本标准研究对象为磺酰脲类除草剂，相对分子质量集中在300～500之间，GPC的分离原理与固相萃取小柱的主要区别：固相萃取小柱是利用填料、样品和淋洗剂之间极性的差别来达到分离的目的，而凝胶色谱仪则是利用化合物中各组分分子大小不同而淋出顺序先后也不同而达到分离目的的，淋洗溶剂的极性对分离的影响并不起决定作用，对于净化脂肪酸、色素较多的样品具有明显的优势。

目标物在GPC柱上的流出规律必须进行研究以确定合适的收集方式。因此本研究采用基质加入标准溶液，分段收集的方式，经氮吹处理后供液质分析，以确定磺酰脲类除草剂在GPC柱上的流出规律，从而确定收集时间段。分段收集数据如图2所示，磺酰脲类除草剂主要集中在14～27 min中流出，获得较好的净化效果。

图2 14～29 min GPC柱目标物流出质谱图Fig.2 Mass spectra of GPC column objective logistics at 14 to 29 min

2.2 色谱及质谱条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化

分别比较了不同类型的反相色谱柱(Waters BEH C18, Waters HSS T3, Waters HSS C8)对待测物质的色谱分离效果。我们发现Waters BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)上获得了20种磺酰脲类除草剂较为理想的分离效果，详见图3。

由于目标物的弱酸性质，在正离子电离模式下溶液中能够电离出H+。所以，在流动相中适当加入酸性物质可以促进目标物的电离，从而获得较高的离子化效率。因此，本文选取0.1%甲酸水作为流动相进行实验，并获得了最佳实验结果。选择梯度洗脱方式，优化流动相梯度洗脱条件，在8 min内实现了目标化合物的快速分离测定。

1.烟嘧磺隆； 2.甲酰胺磺隆； 3.环氧嘧磺隆； 4.甲基噻吩磺隆； 5.甲磺隆； 6.醚磺隆； 7.醚苯磺隆； 8.氯磺隆； 9.胺苯磺隆； 10.四唑嘧磺隆； 11.甲磺胺磺隆；12.三氟啶磺隆；13.丙苯磺隆；14.氟磺隆；15.吡啶磺隆；16.氯嘧磺隆；17.乙氧嘧磺隆；18.氟胺磺隆；19.甲基氟嘧磺隆；20.环丙嘧磺隆图3 20种磺酰脲类除草剂多反应监测质谱图Fig.3 Mass spectrum of 20 kinds of sulfonylurea herbicides

2.2.2 质谱条件的优化

根据目标物的化学电离性质，本文选用正电离模式(ESI+)，采用蠕动泵直接进样的方式进行质谱条件优化。根据CAC和EU第657/2002/EEC号决议有关规定，选择2对离子监测MRM即可满足。通过仪器自带软件Masslynx4.1的自动优化软件IntelliStart，对目标物的锥孔电压、碰撞能、定量离子和辅助定性离子进行了优化和确定。

2.3 标准曲线、线性范围及检出限

将标准储备液用初始流动相梯度稀释成6种不同浓度的标准溶液(0.5、1、5、10、20、50 μg/L)。然后上机用本方法测定，绘制标准曲线。以标准物的浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得线性回归方程及相关系数。并根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)中方法检出限的一般确定方法，依据公式通过重复空白实验7次计算得各组分最低检测浓度，结果见表3。结果表明，本方法的检出限优于现有相关文献[5]。在0.5～50 μg/L范围内目标化合物取得了较好的线性，并且相关系数r≥0.995。

表3 20种磺酰脲类除草剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限Table 3 Linear range, linear equation, correlation coefficient and detection limit of 20 kinds of sulfonylurea herbicides

2.4 方法的回收率与精密度

对一已知实际环境土壤样品(未检出目标物)进行添加回收率和精密度实验，样品分别添加低、中、高(1、5、10 μg/L)3种质量浓度的标准溶液(每个添加浓度平行测定6次，并计算其相对标准偏差RSD)，按本方法进行实验，用液相色谱-串联质谱进行测定。方法回收率在65.7%～106.1%之间，精密度在2.3%～12.1%之间，结果见表4。

表4 20种磺酰脲类除草剂的相对标准偏差和加标回收率(n=6)Table 4 Relative standard deviation and marking recovery rate of 20 benzoylurea herbicides (n=6)

2.5 样品的测定

应用本方法对中部某省农用地土壤详查近2 000组样品进行了分析测定。分析结果表明，其中有120组样品中检出了甲酰胺磺隆、甲磺隆、氯磺隆、甲磺胺磺隆、氟胺磺隆和甲基氟嘧磺隆等几种除草剂，质量分数为13.5～217.4 ng/kg。

3 结论

建立了加速溶剂提取、凝胶渗透色谱法净化-超高效液相色谱/串联质谱快速测定土壤中20种磺酰脲类除草剂的方法。土壤经过冷冻干燥、粉碎过筛，用加速溶剂仪提取，经凝胶渗透色谱净化，以超高效液相色谱/串联质谱(UPLC-MS/MS)多级监测模式(MRM)外标法进行定性定量分析。结果表明，该方法具有较高的准确度和精密度，具有灵敏、准确和操作简单等特点，可以作为土壤中衡量磺酰脲类除草剂的监测方法。