sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鳞状细胞癌中的表达及与化疗疗效的关系

王丽华，郭君兰，胡彦伟，焦智民

安阳市肿瘤医院肿瘤内科，河南 安阳 455000

近年来，随着人们生活习惯的改变和生活节奏的加快，食管癌的发病率呈不断增长的趋势。食管癌主要包括鳞状细胞癌、腺癌两种病理类型，其中以鳞状细胞癌更为多见，预后差。早期食管鳞状细胞癌一般经手术治疗可控制其病情进展，而实际临床就诊的食管癌患者以中晚期居多，往往无法实施手术，且部分患者不愿接受手术治疗，需采用化疗干预[1]。肿瘤标志物对于评估肿瘤患者的病情、治疗效果及预测预后十分重要。近年来，陆续有报道指出，血清指标中，可溶型主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关蛋白A（soluble major histocompatibility complex classⅠchain-related protein A，sMICA）、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）及基质金属蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP9）是重要的肿瘤标志性分子，与肿瘤进展或恶化密切相关[2-5]，但其在食管鳞状细胞癌中的表达情况及临床意义尚缺乏报道。为此，本研究以95例食管鳞状细胞癌组织为对象，分析食管鳞状细胞癌中sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表达情况及与化疗疗效的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月至2017年1月安阳市肿瘤医院收治的95例食管鳞状细胞癌患者，取其食管鳞状细胞癌组织。纳入标准：①通过病理检查确诊为食管鳞状细胞癌；②未接受过胸部放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗；③因错过手术时机、无法耐受手术或不愿接受手术治疗，均接受化疗干预。排除标准：①预计生存期＜3个月；②有其他消化系统肿瘤病史；③合并其他部位原发性肿瘤；④合并冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肝硬化、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病。95例食管鳞状细胞癌患者中，男57例，女38例；年龄26～75岁，中位年龄为53岁；病灶部位：食管上段51例，食管中段44例；美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）食管癌 TNM 分期[6]：Ⅰ期 19例，Ⅱ期42例，Ⅲ期34例；分化程度：中低分化45例，高分化50例。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均了解本次研究的目的和意义并签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

兔抗人sMICA多克隆抗体、兔抗人CYFRA21-1多克隆抗体、兔抗人MMP9多克隆抗体及二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PAS染色液由安阳市肿瘤医院实验室配置。恒温干燥箱购自上海跃进医疗器械厂，医学显微镜及其配套图像采集系统购自日本OLYMPUS公司。

1.3 sMICA、CYFRA21-1、MMP9检测及判定标准

均通过活检取得全部患者的食管鳞状细胞癌组织标本，经过甲醛固定、常规石蜡包埋，制作成4 μm厚的连续切片，采用免疫组化SP法检测，均采取磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作为阴性对照；操作严格按照说明进行，每批染色均以sMICA、CYFRA21-1、MMP9已知阳性切片作为阳性对照。结果由两位高资历病理科医师采用双盲法观察每张切片，sMICA、CYFRA21-1、MMP9蛋白阳性表达细胞表现为细胞质、细胞膜出现区别于背景色的棕黄色细颗粒。400倍显微镜下取典型食管鳞状细胞癌区10个视野观察，根据阳性细胞的染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。阳性细胞染色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占百分比：显微镜下观察10个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，取10个视野的百分比平均数，＜5%为0分，≥5%且＜25%为1分，≥25%且＜50%为2分，≥50%且＜75%为3分，≥75%为4分。染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分相乘，结果以0～4分为阴性表达，5～12分为阳性表达。

1.4 疗效评价标准

所有患者均接受化疗，并保持密切随访，随访期间行肝肾功能检查及胸部计算机断层扫描（CT）复查。化疗结束后4周参考实体瘤疗效评价标准1.1版[7]评价近期疗效：完全缓解（CR），食管鳞状细胞癌病灶消失且维持至少4周；部分缓解（PR），食管鳞状细胞癌病灶长径总和较前缩小≥30%，且维持至少4周；疾病进展（PD），食管鳞状细胞癌病灶长径总和较前增加≥20%或出现新病灶；病情稳定（SD），介于PR与PD之间；总有效率（overall response rate，ORR）=（CR+PR）例数/总例数×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；等级资料的比较采用秩和检验；疗效的影响因素分析采用多元Cox回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表达情况

95例食管鳞状细胞癌组织中，59例食管鳞状细胞癌组织中sMICA呈阳性表达，阳性表达率为62.11%，表现为淡黄色至深棕色颗粒，定位于细胞质；62例食管鳞状细胞癌组织中CYFRA21-1呈阳性表达，阳性表达率为65.26%，表现为淡黄色至深棕色颗粒，定位于细胞质；75例MMP9呈阳性表达，阳性表达率为78.95%，表现为淡黄色至棕褐色颗粒，定位于细胞质。（图1）

2.2 不同临床特征食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达情况的比较

图1 食管鳞状细胞癌细胞中sMICA、CYFRA21-1、MMP9阳性、阴性表达情况（免疫组化染色，×400）

不同TNM分期的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中sMICA、CYFRA21-1、MMP9阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=26.904、18.767、10.167，P＜0.05）；不同分化程度的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中sMICA、CYFRA21-1、MMP9阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=11.634、3.995、10.646，P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表达情况（n=95）

2.3 sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达情况与化疗疗效的关系

95例食管鳞状细胞癌患者化疗后，CR 25例，PR 31例，SD 21例，PD 18例，ORR为58.95%（56/95）。sMICA、CYFRA21-1、MMP9阴性表达的患者疗效均优于阳性表达的患者，差异均有统计学意义（Z=2.522、2.752、2.746，P＜0.05）。（表2）

表2 不同sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达情况的食管鳞状细胞癌患者的疗效情况

2.4 食管鳞状细胞癌患者化疗疗效影响因素的多元Cox 回归分析

以食管鳞状细胞癌患者化疗疗效为因变量，以TNM分期、分化程度及sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达为自变量（赋值情况：Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2；高分化=0，中低分化=1；sMICA阴性=0，阳性=1；CYFRA21-1阴性=0，阳性=1；MMP9阴性=0，阳性=1），进行多元Cox回归分析，结果显示，TNM分期、分化程度及sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达均是食管鳞状细胞癌患者化疗疗效的独立影响因素（P＜0.01）。（表3）

表3 食管鳞状细胞癌患者化疗疗效影响因素的多元Cox回归分析

3 讨论

肿瘤细胞凋亡后细胞表面的MICA脱落到外周血里可形成sMICA，研究报道，在肺癌、乳腺癌等患者中sMICA水平较健康者及相应良性病变者高[8-9]。此外，从肿瘤免疫学角度分析，sMICA可降低肿瘤表面MICA的表达，诱导T细胞与自然杀伤细胞表面的活化受体发生内化降解，从而对自然杀伤细胞的杀伤活性产生抑制作用，引起肿瘤逃逸[10]。CYFRA21-1是角蛋白CK19的片段（属于酸性蛋白），通常分布在层状或鳞状上皮等正常组织表面，而当细胞发生癌变时，CYFRA21-1在恶性上皮细胞中可激活蛋白酶，促进细胞的降解，继而可出现在上皮肿瘤细胞的细胞质中，并可大量释放入血。CYFRA21-1对食管鳞状细胞癌的诊断灵敏度较高，如樊卫等[11]的研究证实CYFRA21-1与其他肿瘤标志物联合检测能提高食管鳞状细胞癌诊断的灵敏度（＞90%）和准确度（＞85%）。作为MMP家族中分子量最大的酶，MMP9可作用于细胞外基质而使细胞外蛋白水解，水解片段可沉积于肿瘤微环境中，促进肿瘤细胞侵袭。研究显示，MMP9还具有分解层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白等多种底物的作用，继而可破坏机体防御肿瘤浸润的天然防线[12]。MMP9在包括食管癌在内的许多上皮来源的肿瘤或间质肿瘤中过表达。张鲁川等[13]研究指出，低分化及晚期食管鳞状细胞癌易形成血管生成拟态，而MMP9对其有促进作用。另有学者认为，在肿瘤侵袭转移过程中，MMP可通过某种作用机制促使sMICA介导肿瘤免疫逃逸的发生[14]。本研究选取通过病理确诊的95例食管鳞状细胞癌患者，通过手术取得组织标本，经甲醛固定、常规石蜡包埋、切片，采用免疫组化SP法检测sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达情况。结果显示，食管鳞状细胞癌组织中sMICA阳性表达59例（62.11%），CYFRA21-1阳 性 表 达 62例（65.26%），MMP9阳性表达75例（78.95%）；且不同TNM分期及分化程度的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中sMICA、CYFRA21-1、MMP9阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；表明肿瘤标志性分子sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鳞状细胞癌中阳性表达率高，可能参与了肿瘤的进展。

目前，关于上述3种肿瘤标志物与食管鳞状细胞癌疗效的关系尚无明确报道，仅梁敏等[15]的报道认为全腔镜食管癌根治术联合紫杉醇类+铂类（TP）化疗方案有助于降低患者血清sMICA、CYFRA21-1、MMP9水平，认为其可能与临床疗效及预后密切相关。本研究95例患者化疗后ORR达58.95%，进一步统计发现sMICA、CYFRA21-1、MMP9阴性表达的患者疗效优于阳性表达的患者，且多元Cox回归分析结果提示，TNM分期、分化程度、sMICA、CYFRA21-1、MMP9表达均是食管鳞状细胞癌患者化疗疗效的独立影响因素，提示肿瘤标志性分子sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鳞状细胞癌中的高阳性表达率可能影响化疗疗效，可能与sMICA、CYFRA21-1、MMP9直接或间接影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖与凋亡，进而参与疾病进展及影响化疗敏感性有关，但具体影响机制仍需进一步探讨。此外，由于目前本研究所选病例大部分仍在随访中，sMICA、CYFRA21-1、MMP9对患者生存情况的影响还需后期补充论证。