泛素样含PHD和环指域1在鼻咽癌放化疗患者中的表达水平及与患者预后的关系

谷泉，彭爱丽，王玉珏，赵暘，陈志强

1沈阳市第四人民医院耳鼻喉科，沈阳 110000

解放军第四六三医院2耳鼻喉科，3病理科，沈阳 110041

鼻咽癌作为恶性肿瘤性疾病，在中国，尤其是南方地区高发，且发病率持续上升。研究发现，中国鼻咽癌患者的发病和病死人数分别占全球鼻咽癌发病和病死总人数的38.29%和40.14%，发病率和病死率高于世界平均水平（1.2/10万和0.7/10万），且男性多于女性[1]。中国的多数鼻咽癌患者确诊时已发展为晚期，5年生存率仅为62.69%[2]。鼻咽癌患者发病初期无明显临床症状，主要表现为打喷嚏、流脓涕、鼻塞、涕中带血、耳闷和听力下降等症状，严重者还会引发眶周阵发性疼痛[3]。局部复发、局部浸润和远处转移常导致鼻咽癌患者的病情加重，也是导致鼻咽癌患者放射治疗后失败的主要原因[4-5]。目前，在中国，放化疗是鼻咽癌的主要治疗方式，但是，在治疗过程中，患者会出现一系列严重的不良反应，且不能改善患者的生存情况[6]。在放化疗期间，由于缺乏灵敏度和特异度均较高的鼻咽癌诊断指标，常常出现放化疗过度的情况，影响鼻咽癌患者的预后。因此，亟需在鼻咽癌患者的放化疗期间寻求具有较高灵敏度和特异度的指标来指导鼻咽癌患者临床放化疗的程度和时间，以达到最佳的治疗效果。泛素样含PHD和环指域1（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）是一种与细胞增殖、凋亡等生物学过程密切相关的核蛋白基因，在人类多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。UHRF1定位于人类染色体19p13.3上[7]。UHRF1在整个肿瘤细胞周期中均有表达，且不受细胞周期的调控，随着细胞增殖能力的提高，UHRF1的表达量也随之提高，在肿瘤细胞中升高异常明显。鉴于其在人类多种肿瘤细胞中过表达，目前，UHRF1被认为在宫颈癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中具有肿瘤标志物的价值[8-10]。但是，关于UHRF1在鼻咽癌中的作用的报道较少。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对122例鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平进行检测，通过分析鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达与患者临床特征和预后的关系，探讨其作为鼻咽癌肿瘤标志物的价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2003年1月至2010年12月沈阳市第四人民医院收治的122例接受根治性治疗鼻咽癌患者。纳入标准：①主要症状为流鼻涕、鼻塞、听力下降和头痛等；②经组织细胞学、病理学检查确诊为鼻咽癌；③经磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）等影像学检查显示存在可测量病灶；④行放化疗或手术等根治性治疗；⑤卡氏功能状态（Karnofsky performance status，KPS）评分≥70分；⑥心电图、血常规检查正常；⑦预计生存期超过6个月。排除标准：①合并精神、意识障碍；②合并肝、肾功能不全；③合并心脑血管疾病。122例鼻咽癌患者中，男88例，女34例；年龄为49～75岁，平均年龄为（54.0±2.2）岁；TNM分期[11]：Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期32例，Ⅳ期63例。收集122例鼻咽癌患者的鼻咽癌组织标本和14例疑似鼻咽癌患者经检验为阴性样本的正常组织。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有研究对象均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 组织样本采集方法

所有疑似鼻咽癌患者均进行纤鼻咽镜检查，发现异常者通过纤维鼻咽镜获取122例鼻咽癌患者的鼻咽癌组织（1 cm3大小），经生理盐水清洗后，样品保存于-80℃冰箱备用。活检组织通过病理学检查确诊后，患者采取外照射、腔内近距离放疗、X线立体定向放疗和组织间插植和化疗等根治性治疗。

1.3 实时荧光定量PCR 法检测鼻咽癌组织中UHRF1表达水平

观察不同临床分期鼻咽癌患者鼻咽癌组织及正常组织中UHRF1的表达水平。取出冻存组织，采用RNA提取试剂盒提取RNA，采用反转录试剂盒获得cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，上述试剂盒均购自中国北京全式金生物技术有限公司。根据UHRF1序列，参照刘新城[12]的方法设计PCR引物（表1）。根据荧光定量PCR扩增曲线计算UHRF1mRNA的表达水平。UHRF1的表达情况由2位临床医师在不知患者临床资料的情况下进行评价。将UHRF1的表达水平由低到高进行划分，其中，UHRF1在鼻咽癌组织中的表达水平与UHRF1在正常组织中的表达水平相同，记为“-”；UHRF1在鼻咽癌组织中的表达水平是UHRF1在正常组织中表达水平的2～4倍，记为“+”；UHRF1在鼻咽癌组织中的表达水平是UHRF1在正常组织中表达水平的5～6倍，记为“++”；UHRF1在鼻咽癌组织中的表达水平是UHRF1在正常组织中表达水平的6倍以上，记为“+++”。“-”表示UHRF1阴性表达，“+、++、+++”表示UHRF1阳性表达。

表1 UHRF1和GAPDH引物序列

1.4 随访

所有患者于放化疗期间每周体检1～2次，所有患者治疗结束1个月后以门诊、电话等方式进行随访，5年后随访终止，如通过电话无法联系到患者或其家属时定为失访。随访内容：患者的治疗效果和术后生存情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中UHRF1的表达水平

实时荧光定量PCR法检测结果显示，正常组织、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平比较，差异有统计学意义（F=580.592，P＜0.01）。随着TNM分期的增高，鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平逐渐升高。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平均高于正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平均高于Ⅰ期，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平均高于与Ⅱ期，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平高于Ⅲ期，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 122例鼻咽癌患者鼻咽癌组织和14例正常组织中UHRF1 mRNA的表达水平（±s）

表2 122例鼻咽癌患者鼻咽癌组织和14例正常组织中UHRF1 mRNA的表达水平（±s）

注：a与正常组织比较，P＜0.05；b与Ⅳ期鼻咽癌组织比较，P＜0.05；c与Ⅲ期鼻咽癌组织比较，P＜0.05；d与Ⅱ期鼻咽癌组织比较，P＜0.05

组织类型正常组织（n=14）Ⅰ期鼻咽癌组织（n=10）Ⅱ期鼻咽癌组织（n=17）Ⅲ期鼻咽癌组织（n=32）Ⅳ期鼻咽癌组织（n=63）UHRF1 mRNA表达0.94±0.15 1.45±0.42a b c d 2.45±0.24a b c 4.45±0.31a b 6.45±0.66a

2.2 不同临床特征鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达情况

不同分化程度、TNM分期鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），不同年龄、性别、淋巴结转移情况和远处转移情况鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 122例不同临床特征鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的阳性表达情况

2.3 不同UHRF1表达情况的鼻咽癌患者的术后生存情况

不同UHRF1表达情况的鼻咽癌患者的1、2和3年生存率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同UHRF1表达情况的鼻咽癌患者的4、5年生存率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。随着UHRF1表达水平的升高，鼻咽癌患者的5年生存率逐渐降低；随着随访年限的增长，鼻咽癌患者的生存率逐渐降低（χ2=13.114、38.406、59.396、67.248，P＜0.01）。（表4）

表4 不同UHRF1表达情况鼻咽癌患者的术后生存情况[n（%）]

3 讨论

鼻咽癌是中国常见的头颈部恶性肿瘤，放化疗是其主要治疗方式，但是由于缺乏敏感的临床指标，过度放化疗现象时常发生。UHRF1作为鼻咽癌的肿瘤标志物具有重要研究价值。本研究利用实时荧光定量PCR法检测鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平，结果发现，UHRF1在鼻咽癌组织中的表达水平随着患者TNM分期的增加而逐渐升高，表明UHRF1的表达水平与鼻咽癌患者的TNM分期可能有关，但与患者的年龄、性别、淋巴结转移情况和远处转移情况可能无关。UHRF1的表达水平与治疗后每年的鼻咽癌患者的存活人数呈负相关，说明UHRF1的表达强度可以作为监测鼻咽癌患者预后情况的重要指标。

UHRF1的肿瘤标志物作用可能是通过以下方式实现的。Hopfner等[13]研究发现，UHRF1通过调节拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）的表达阻断细胞间接触抑制的信号，从而促进肿瘤细胞的增殖。Jeanblanc等[14]研究发现，UHRF1的高表达促进了TopoⅡ的表达，同时，UHRF1的功能结构域调节组蛋白翻译后修饰及DNA甲基化过程，抑制抑癌基因的表达，启动肿瘤细胞的生长[10]。UHRF1通过自身泛素化和泛素化核蛋白（PEST），降解细胞周期相关蛋白或某些转录因子，使肿瘤细胞不受细胞周期的调控，从而过度增殖。Achour等[15]发现UHRF1的下调能够降低血管表皮生长因子的基因表达，并增强p16（INK4A）和RB1的基因表达。说明UHRF1能够通过对肿瘤内血管表皮生长因子的表达进行调节从而对肿瘤的形成起营养支持作用。因此，UHRF1在肿瘤的发生、发展过程中均具有重要作用。

综上所述，鼻咽癌患者鼻咽癌组织中UHRF1的表达水平与鼻咽癌细胞的分化程度和鼻咽癌的TNM分期可能有关，且UHRF1的表达水平越高，患者的预后越差。UHRF1作为鼻咽癌的肿瘤标志物，将为鼻咽癌的临床诊断和治疗提供可靠、准确的理论依据，具有重要的临床应用价值。