贵州产白及组培瓶苗分级标准及其验证

陈 磊， 唐成林， 熊 万， 王礼科， 罗夫来， 赵 致

(1.贵州大学 农学院， 贵州 贵阳 550025; 2.贵州省药用植物繁育与种植重点(工程)实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州省农业展览馆， 贵州 贵阳 550001)

白及〔Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.〕别名连及草，为兰科多年生草本药用植物[1]。喜潮湿，阴生环境下生长。原产于长江流域，主产于贵州、江西、四川、湖南等地[2]。白及以块茎入药，含有白及胶多糖、多酚类、菲类等物质，性苦，具有消肿生肌、收敛止血、消炎抗菌的药理作用[3-6]。随着中医药的发展，中药材备受青睐，在贵州大规模栽培中药材，但很多地方培育的种苗质量参差不齐。随着市场需求的变化，对药材种苗质量要求越来越高。因此，对白及组培瓶苗的质量进行等级划分对贵州产白及组培瓶苗质量的分级、市场的销售和栽培有着重要意义。近年来，对白及的研究主要集中在组织要培养[7-9]、种质资源[10-11]和药理作用等方面[12-13]。白及种苗质量方面的研究相对较少，仅有张智慧[14]对云南产白及组培苗质量分级标准进行初步研究。目前，针对贵州产白及组培瓶苗质量等级的划分和组培瓶苗质量与存活率关系的研究未见报道。为此，笔者以白及组培瓶苗为试验材料，对组培瓶苗农艺性状进行相关性分析、主成分分析和K-均值聚类分析，制定出贵州产白及组培瓶苗质量分级初级标准，通过组培瓶苗存活率、植株长势等确定等级划分的科学性与合理性，以期为贵州产白及组培瓶苗的质量分级、销售、炼苗移栽提供参考和借鉴。

1材料与方法

1.1试验材料

白及种子：由大方县德馨堂中医院提供。通过组培方法将白及种子培育成幼苗，再转接到假鳞茎诱导培养基上培养100 d左右获得具有根、茎、叶的完整白及组培瓶苗；栽培基质为椰子壳、蛭石和有机质，能很好的保持土壤的透气性和排水效果，同时能为白及苗的生长提供所必须的营养元素。

1.2试验方法

1.2.1白及组培瓶苗的分级将白及组培瓶苗从培养瓶中取出，随机选择完整的植株300株，对待分级组培瓶苗数量(300株)进行巴特利特球形检验，确定选择的样本数是否满足质量分级的要求。测量植株假鳞茎直径(X1)、株高(X2)、叶片数(X3)、叶宽(X4)、叶长(X5)、茎粗(X6)、根数(X7)等农艺形状，将所测得数据进行相关性分析、主成分分析以及K-均值聚类分析，对白及组培瓶苗质量等级进行初步划分，分级作为白及组培瓶苗的初级分级标准。

1.2.2白及组培瓶苗分级标准的验证按照等级将白及组培瓶苗移栽至已配好的基质上，进行盆栽试验，每盆5株，每个等级20盆，培养90 d， 比较不同等级白及组培苗的存活率、相对叶绿素含量(使用SPAD仪器进行测定)的变化，各等级白及植株假鳞茎、株高、叶长和叶宽的平均生长量以及出芽率和单株苗的新芽数的差异，考察不同等级白及组培瓶苗等级划分的合理性。

存活率=(存活的苗数÷总苗数)×100%。

1.3数据统计与分析

采用Microsoft Office Excel2019对数据进行统计，利用SPSS23.0对白及组培苗的假鳞茎直径、株高等指标进行相关性分析、主成分分析、K-均值聚类分析和作图。

2结果与分析

2.1白及组培瓶苗等级的划分

2.1.1白及农艺性状指标分布频率由图1可知，除根数以外，假鳞茎直径、株高、叶片数、叶宽、叶长和茎粗基本满足正态分布，分别集中分布在2.5～7.5 mm、2～8.75 cm、3～4片、4～10 mm、0.75～6 cm和1.43～3.43 mm范围。

图1白及各农艺性状指标频率分布

Fig.1 Frequency distribution of various agronomic traits indicators ofBletilla

2.1.2白及组培瓶苗样本数有效性检验经巴特利特球形检验，取样足够度的 Kaiser-Meyer-Olkin度量检验系数(KMO)为0.642>0.5，显著性Sig(P)=0<0.05，说明样本数结构效度合格，可以进行相关性分析、主成分分析和K-值聚类分析。

2.1.3白及组培瓶苗农艺性状的相关性从表1可知，白及假鳞茎直径与株高、叶宽、叶长及根数存在极显著正相关，与茎粗存在显著正相关，与叶片数存在相关性但并不显著；株高与叶片数、叶宽、叶长、茎粗、根数均存在极显著正相关；叶片数与叶宽、叶长、茎粗存在极显著正相关，与根数存在相关性但不显著；叶宽与叶长、茎粗、根数均存在极显著正相关；叶长与茎粗、根数存在极显著正相关；茎粗与根数存在极显著正相关。其中，株高和叶长的相关系数最高，达0.944。

表1 白及组培瓶苗各农艺性状间的相关系数

注：*、**分别表示在0.05和0.01水平相关性显著和极显著。

Note：*and** indicate significant correlations at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

2.1.4白及组培瓶苗农艺性状主成分分析主成分分析是将不存在直接相关性状的数据进行降维处理，从而达到综合评价性状目标的方法[15]。试验从7个特征合计值中，选取了特征合计值较大的3个主成分(表2)。第I主成分的贡献率为39.832%，第II个主成分的贡献率为17.153%，第III主成分的贡献率为15.125%，3个主成分的累计贡献率为72.11%，能有效反应数据的变化趋势，同时也说明前三个主成分包含了白及组培瓶苗农艺性状大量的指标信息含量，符合主成分分析的要求。

从表3可知，第I主成分与株高、叶长呈较大的相关性，相关系数分别为0.855和0.837。因此第I主成分主要反映株高的生长性状，可以称为株高生长因子。第II主成分与叶片数、叶宽、茎粗、根数呈正相关，相关系数分别为0.591、0.229、0.664和0.234；与假鳞茎直径、株高和叶长呈负相关，相关系数分别为-0.223、-0.4和-0.417，因此第II主成分主要反映的是植株叶片和茎的生长情况。第III主成分与假鳞茎直径和根数呈较大的相关性，相关系数为0.423和0.168，第III主成分主要反映白及茎下部生长情况，因此可以称为假鳞茎生长发育和根部生长因子。

表2白及组培瓶苗农艺性状3个主成分的特征合计值与贡献率

Table 2 Eigen values of three principal components and their contributions of the agronomic traits ofBletillatissue culture seedlings

主成分Principal component特征合计Eigen value方差贡献率/%Contribution累计方差贡献率/%Cumulative contributionI2.78839.83239.832II1.20117.15356.985III1.05915.12572.110

第一主成分的表达式为Y1=0.326X1+0.512X2+0.236X3+0.396X4+0.501X5+0.325X6+0.246X7，表明，第一主成分主要由变量X2(株高)、X5(叶长)和X1(假鳞茎直径)所决定。第二主成分表达式为Y2=-0.203X1-0.365X2+0.474X3+0.209X4-0.381X5+0.606X6+0.214X7，其主成分主要是由变量X3(叶片数)和X6(茎粗)决定；第三主成分表达式为Y3=0.441X1-0.207X2-0.551X3+0.163X4-0.248X5-0.032X6+0.661X7，其主成分主要是由变量X1(假鳞茎直径)和X7(根数)决定。综合三个主成分的表达式，参考相关性分析结果、3个主成分的方差贡献率和各成分指标得分，参照假鳞茎与株高是评价白及质量的主要考虑指标的研究结论[14]，最终将假鳞茎直径、株高2个主要指标作为贵州产白及组培瓶苗质量分级的主要考虑指标。

表3白及组培瓶苗主成分与农艺性状因子的相关系数

2.1.5白及组培瓶苗质量等级的初步划分由表4可知白及组培瓶苗假鳞茎最终的3个聚类中心值分别为5.06 mm、4.54 mm和6.67 mm；株高的聚类中心值分别为4.59 cm、4.29 cm和7.66 cm。将聚类中心值作为白及组培瓶苗质量等级划分的标准，结合实际生产，白及组培瓶苗质量划分为3个等级， I级苗为假鳞茎直径≥7 mm，株高≥8 cm；II级苗假鳞茎直径≥5.5 mm，株高≥4 cm；III级苗假鳞茎直径≥4 mm，株高≥4 cm(表5)。

表4白及组培瓶苗2个等级划分指标的聚类中心

Table 4 Cluster center of two grades ofBletillatissue culture seedlings

农艺性状 Agronomic traitsⅠⅡⅢ假鳞茎直径/mm Bulb diameter5.064.546.67株高/cm Plant height4.594.297.66

表5白及组培瓶苗的分级标准

Table 5 Grading standards ofBletillatissue culture seedlings

农艺性状 Agronomic traitsⅠ级Ⅱ级Ⅲ级假鳞茎直径/mm Bulb diameter≥7≥5.5≥4株高/cm Plant height≥8≥4≥4

2.2白及组培瓶苗等级划分合理性的验证

2.2.1不同等级白及组培瓶苗炼苗情况及存活率炼苗后， I级苗的植株健壮，叶片宽厚肥大、深绿色，假鳞茎能很快由绿色变为白色，死亡率低，长势良好，有新叶片、新芽长出，植株高，其存活率为91.67%；II级苗植株健壮，叶片深绿色，长势良好，有新叶长出，植株较高，其存活率为68.33%；III级苗的植株较为健壮，叶绿色，长势缓慢，植株较高，其存活率为56.67%；等外苗的植株弱小，叶片小、浅绿色，不易适应外界条件，存活率低，为34.54%。

2.2.2不同等级白及组培瓶苗移栽后叶绿素变化情况从图2可知，不同等级白及组培瓶苗移栽后，缓苗期相对叶绿素含量下降，缓苗期后，叶绿素含量开始上升，最后达到相对稳定状态。但在各个等级之间相对叶绿素含量差异不明显。

图2不同等级组培瓶苗的叶绿素变化

Fig.2 Chlorophyll at different grades ofBletillatissue culture seedlings

2.2.3炼苗后白及组培瓶苗质量的比较从表6可知，培养90 d后，假鳞茎直径表现为III级苗>I级苗>II级苗，I级苗和II级苗假鳞茎直径平均增长量小于III级苗，这是因为I级苗和II级苗炼苗时的基础值较大。随着培养时间延长，I级苗植株叶片出现死亡，即“倒苗”现象，导致I级苗株高、叶长都小于II级苗和III级苗；叶宽略大于III级苗，小于II级苗。白及植株倒苗后，主要是体现在新芽的产生和根数的增加，I级苗出芽率达70%，新芽数在1～2个/株，且多数假鳞茎已经分叉成“弓”形；II级苗假鳞茎直径平均增长量相对较小，但株高、叶长、叶宽的平均生长量略大于I级苗和III级苗，“倒苗”数较少，出芽率约50%，且新芽数多为1个/株，根数基本无明显变化；III级苗假鳞茎直径平均增长量略大于I级苗和II级苗，主要是因为假鳞茎直径的基础值都相对集中，炼苗期间生长状况良好，几乎无“倒苗”现象，植株地上部分健壮，有利于白及苗地下假鳞茎的生长，但是出芽率远低于I级苗和II级苗，仅为10%，新芽数均为1个/株。

表6 不同等级白及组培瓶苗炼苗后的农艺性状

3结论与讨论

对白及组培瓶苗的质量分级不仅要具有一定的科学性与合理性，还要与生产实践和实际应用相结合。白及组培瓶苗主成分分析结果表明，白及组培瓶苗的质量分级主要指标为假鳞茎直径、株高、叶片数。有研究指出[16]，白及假鳞茎的质量是决定白及苗存活的关键因素，假鳞茎直径越大，其存活率越高，株高和叶片数是体现白及苗健壮程度。通过对组培瓶苗进行相关性分析、主成分分析和K-聚类分析，确定了白及组培瓶苗质量分级指标为假鳞茎直径和株高，并将组培瓶苗分为3个等级，I级苗为假鳞茎直径≥7 mm，株高≥8 cm；II级苗假鳞茎直径≥5.5 mm，株高≥4 cm；III级苗假鳞茎直径≥4 mm，株高≥4 cm。白及组培瓶苗质量越好，移栽后其植株存活率越高，即I级苗存活率(91.67%)>II级苗(68.33%)>III级苗存活率(56.67%)>等外苗存活率(34.54%)；I级苗假鳞直茎总体平均增长值大于II级苗，微小于III级苗，但对于个别植株而言，其增长量远大于II级和III级苗，出芽率和新芽数也相对较高，出芽率为70%，新芽数一般为1～2个/株；每个等级的组培瓶苗在移栽后其相对叶绿素都有下降的趋势，度过缓苗期，相对叶绿素含量开始上升，到一定的程度后趋于稳定，但各等级苗之间的相对叶绿素差异不明显。