化学酶法制备盐酸甲氧那明的工艺研究

祁永凯，肖延铭＊，张飞龙，华超，葛文强，李敬亚，梁阿朋

（1.长兴制药股份有限公司，浙江长兴 313100；2.郑州大学 化学与分子工程学院，河南郑州 450001）

盐酸甲氧那明又称甲氧苯丙甲胺盐酸盐（C11H17ON·HCl），是一类β-肾上腺素受体激动剂，相比较麻黄碱的平喘作用更加有效，对于心血管系统产生的副作用较少，临床上多以复方制剂的形式使用。复方甲氧那明中各单药均以小剂量组合，在临床上却能发挥良好的支气管解痉作用[1]，多用于不能耐受麻黄碱的支气管哮喘患者[2-4]，复方甲氧那明胶囊具有止咳、祛痰、平喘等作用，有临床指标及临床有效率证明，大大缩短了病程，减少了患者痛苦[5]。

一般制备甲氧那明的方法是以2-甲氧基苯甲醛为起始物，在碱性条件下硝基乙烷与其发生缩合反应。在盐酸作用下，铁与三氯化铁将其还原成2-甲氧基苯丙酮，最后加入甲胺的盐酸盐，利用硼氢化钠还原胺化，继而制备得到盐酸甲氧那明[6-8]。由于氧化铂与硝基乙烷价格较高且三氯化铁与铁的使用会产生大量的废水废渣，处理成本较高，在环保监管越来越严的形势下，显得举步维艰。目前，国外报道的合成方法是采用金属催化氢化反应：利用氧化铂作催化2-甲氧基苯基丙酮，在甲胺甲醇溶液中加压氢化反应1～3 h，收率达到90%以上。Zenichi H等[9]报道了另外的一个合成方法，将2-甲氧基苯基丙酮与30%的甲胺甲醇溶液混合，用雷尼镍和二氯化铂催化氢化。国内也有部分企业直接采用钯碳直接催化氢化[10]。日本专利JP3101022报道了盐酸甲氧那明的合成方法，以邻甲氧基苯基丙酮和硝基甲烷为原料，在汞-铝催化剂的条件下回流4～5 h，产率达到81%以上。上述合成方法要用到氧化铂、二氯化铂、钯碳作为催化剂，大大增加生产成本，易产生环境污染，且加氢反应危险性较高。

本文通过化学法与生物酶法的结合，采用化学酶法催化合成盐酸甲氧那明中间体2-甲氧基苯基异丙醇，再通过化学法制备最终成品，尽可能地减少有机溶剂等其他化学试剂的使用，避免采用氢化反应，提高制备安全性与环保经济性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian NMR-400 MHz型核磁共振仪，Waters液相检测器。

质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA清洁试剂盒，均购自Axygen公司；限制性内切酶、DNA连接酶，均购自TaKaRa公司；全基因合成和基因测序，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司提供；胰蛋白胨、酵母提取物，购自Oxoid公司。

醋酐（C4H6O3）、2-甲氧基苯乙酸（C9H10O3）、N-甲基咪唑（C4H6N2）、氢氧化钠（NaOH）、二氯甲烷（DCM）、盐酸（HCl）、葡萄糖（C6H12O6）辅酶——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、碳酸钠（Na2CO3）、对甲苯磺酰氯（TsCl）、对甲苯磺酸（TsOH）、丙酮（CH3COCH3）和乙醇（CH3CH2OH）均为市售分析纯，葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase，GDH）酶液由长兴制药股份有限公司制备。

1.2 合成方法

1.2.1 催化合成所需基因在大肠杆菌中表达

将来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444）的羰基还原酶（Short-chaindehydrogenase/reductase，SDR，GenBank：CP000677.1）由杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行全基因合成，获得重组质粒pET28a-SDR，将此重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，获得大肠杆菌重组表达菌株BL21（DE3）/pET28a-SDR。挑取单菌落接入50 mL含有卡那霉素的LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl，pH 7.0）培养基中，37.0 ℃过夜培养。将8 mL过夜培养物接种于800 mL含有卡那霉素的TB（24 g/L酵母膏、12 g/L胰蛋白胨、5 g/L甘油、2.31 g/L KH2PO4、16.4 g/L K2HPO4·3H2O，pH 7.0）培养基中，37.0 ℃ 220 r/min振荡培养，至发酵液OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2 mmoL/L的IPTG，25.0 ℃诱导培养14 h。发酵完毕后，5 000 r/min离心15 min，收集菌泥。

1.2.2 粗酶液的制备

在烧杯中加入30 g SDR菌泥，倒入50 mmol/L pH 7.0的PBS缓冲液至总体积为100 mL，振荡摇匀，重悬菌体，利用超声波破碎仪破壁30 min，即获得含有目的蛋白，浓度为300 g/L的SDR粗酶液。GDH粗酶液制备方法同上。

1.2.3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）的制备

在室温条件下，1 L三口瓶中加入500 g醋酐，搅拌加入300 g 2-甲氧基苯乙酸（Ⅰ）并升温至60 ℃，搅拌30 min后，缓慢滴加30 g N-甲基咪唑，滴毕继续搅拌30 min后升温至130 ℃回流5 h，关停反应。减压蒸馏除去过量的醋酐，待冷却至室温后加入质量分数为30%的NaOH 300 mL，搅拌30 min后，加入DCM萃取3次，每次200 mL，合并的有机层用100 mL 2 mol/L的HCl洗涤后，常压蒸馏回收DCM，然后减压蒸馏，收集80～90 ℃（2 kPa）的馏分，得221 g 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）[11]。产率73.2%，经HPLC检测，纯度达到98.5%以上。

核磁确证：1H-NMR (CDCl3,ppm) 1.21(s,3H),2.05(br,1H),2.721 (dd,J=7.6Hz,13.6 Hz,1H),2.845 (dd,J=4.6 Hz,13.6 Hz,1H),3.821(s,3H),4.030～4.076(m,1H),6.857～6.924 (m,2H),7.128～7.248 (m,2H)。

1.2.4 酶催化制备2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）

在圆底烧瓶中先后加入100 g底物2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）、1 000 mL水、165 g（1.5 eq）葡萄糖、250 mg 0.2 g/L的NAD、质量分数20%的Na2CO3溶液调节pH至7.0左右，温度保持约37.0 ℃，充分搅拌溶解后各加入200 mL SDR粗酶液与200mL GDH粗酶液，继续用质量分数20%的Na2CO3溶液调节pH至7，最后加入剩余体积的水使得初始总体积控制在2.0 L。反应约12 h后，点板检测2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）完全耗尽。反应结束后，反应液离心，取上层清液，弃去酶渣。用DCM萃取清液，合计3次，每次200 mL，合并有机相，无水硫酸钠干燥2 h。减压旋干并回收DCM，得到淡黄色油状物76 g，产率76%，经HPLC检测纯度为99.1%。

核磁确证：1H-NMR（CDCl3，ppm） 2.122(s,3H,COCH3),3.663(s,2H,COCH2),3.903(s,3H,OCH3),6.865～6.938 (m,2H,ArH),7.11 (dd,J=1.6 Hz,J =7.2 Hz,1H,ArH),7.25(dt,J =1.6 Hz,8Hz,1H,ArH)。

1.2.5 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）的合成

氮气保护，取2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）50 g、三乙胺36.5 g（1.2 eq）、500 mL干燥的DCM，0 ℃环境下搅拌15 min，再开始滴加TsCl 68 g（1.2 eq），滴加完毕后继续搅拌30 min后恢复常温搅拌8 h。反应完毕后，用饱和NaHCO3溶液水洗2次，每次200 mL，收集有机相。旋干DCM，得到油状中间体C17H20O4S（Ⅳ）78 g，经HPLC检测纯度约82%，收率83%。

取上述中间体1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ）50 g，溶于100 mL DMF中，后加入对甲苯磺酸32 g（1.2 eq）、甲胺乙醇溶液（质量分数33%）8 g（1.5 eq），60 ℃回流24 h。点板检测反应完毕。加入200 mL饱和Na2CO3溶液水洗，200 mL的DCM萃取溶液2次，合并有机相。旋干DCM，残留物进行减压蒸馏。收集110～120℃（2 kPa）的馏分，得到32.2 g 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ），淡黄色液体，收率79%，经HPLC检测纯度为98.5%。

核磁确证：1H-NMR(400 MHz,DMSO)d： 1.24(d,J=8.0 Hz,3H,CH3),2.53 (dd,J1=10.0 Hz,J2=6.0 Hz,Ha,CH2) 2.79 (dd,J1=10.0 Hz,J2=6.0 Hz,Hb,CH2),3.20(m,1H,CH),3.81(s,3H,CH3),6.89～7.21(m,4H,Ar-H);13C-NMR(100 MHz,DMSO) d：20.8,33.7,38.5,56.1,59.5,112.4,121.3,127.0,127.7,130.6,158.7。

1.2.6 盐酸甲氧那明（Ⅵ）的合成

在1 L三口瓶中加入90 g 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）和500 mL无水丙酮，0～5 ℃下通入氯化氢气体2 h，有白色沉淀产生，抽滤，用丙酮洗涤，滤饼用乙醇甲苯混合溶剂重结晶，得78.9 g盐酸甲氧那明（Ⅵ）[11]，收率72%，经HPLC检测纯度为99.5%。

核磁确证：1H-NMR(D2O,ppm) 1.16(d,J=6.8 Hz,3H,),2.597(s,3H),2.839(dd,J=6.8 Hz,14Hz,1H),2.932(dd,J=6.4 Hz,14Hz,1H),3.45(m,1H),3.765(s,3H),6.922(t,J=7.6 Hz,1H),6.985(d,J=6.8 Hz,,1H),7.16(d,J=7.2 Hz,1H),7.281(t,J=8.0 Hz,1H)。

2 结果与讨论

2.1 影响酶催化2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）纯度与收率的因素

2.1.1 辅酶NAD的量对酶催化反应的影响

控制不同组别NAD当量，反应12 h取样测量产物2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）的纯度，结果如图1所示。

图1 辅酶NAD含量对反应纯度的影响

由图1可知，辅酶NAD的量控制在0.15～0.30 g/L区间，反应产物的纯度均能达到99.0%以上，继续加大其投量对纯度没有较大的提升，考虑到经济性，辅酶NAD的量应控制在控制在0.2 g/L。其对反应的收率影响较小。

2.1.2 投酶量对酶催化反应的影响

加入不同体积SDR粗酶液与GDH粗酶液以控制初始投酶量，反应12 h取样测量产物2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）纯度，结果如图2所示。

图2 投酶量对酶催化反应的影响

由图2可知，当SDR粗酶液与GDH粗酶液各加入200 mL时，体系SDR与GDH初始菌浓均为30 g/L，最终产物纯度能达到99%以上，再继续加大投酶量提高菌浓，产物纯度变化不大，但是由于菌泥量的增加对于后处理产生负面影响，导致收率会有所降低。综上结果，SDR与GDH菌浓的初始值为30 g/L时，产物2-甲氧基苯丙醇（Ⅲ）经HPLC检测纯度大于99.0%以上且收率理想。

2.1.3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）浓度对酶催化反应的影响

加入不同质量的底物2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）控制底物的浓度，反应12 h取样测量产物2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）的纯度，结果如图3所示。

图3 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）浓度对酶催化反应的影响

由图3可知，在当前反应条件下，能反应的最大浓度为50～80 g/L，且能保证纯度大于99.0%，随着2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）浓度的增加，会对酶产生抑制作用，降低酶活，只有继续加大酶用量才能保证反应完毕，酶量的增加会势必加大生产的成本。

由图4可知，当2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）浓度提升到100 g/L时，达到产物纯度99.1%以上需要将酶量加大到至少90 g/L，投酶量的增加加大了成本。综合考虑，2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）的浓度控制在80 g/L较为适宜。

图4 100g/L 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）反应完全所需酶量

2.1.4 反应温度对酶催化反应的影响

图5 反应温度对酶催化反应的影响

由图5可知，当反应温度在（37.0±0.5）℃酶催化反应中2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）纯度最佳，经HPLC检测达到99.0%以上。

2.1.5 反应pH对酶催化反应的影响

图6 反应pH对酶催化反应的影响

用质量分数20%的Na2CO3溶液动态控制pH至设定值，反应12 h取样测量产物2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）的纯度。由图6可知，当反应pH保持在7.0左右，酶催化活力最佳，2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）纯度经HPLC检测达到99.0%以上。

2.2 影响2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）纯度与收率的因素

（1）投料摩尔比对反应中间体1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ）纯度及收率的影响。

表1 投料摩尔比对1-（2-甲氧基苯基）-2-（4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ

由表1可知，当n(C17H20O4S)、n(TEA)、n(TsCl)的比例为1.0∶1.2∶1.2时，中间体（Ⅳ）HPLC检测纯度达到81.4%，收率83.3%为最佳摩尔比。

（2）投料摩尔比对2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）纯度及收率的影响。

表2 投料摩尔比对2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）纯度及收率的影响

由表2可知，当n(C10H14O2)、n(PTS)、n(CH5N)的比例为1.0∶1.2∶1.5时，2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）经HPLC检测纯度达到98.5%，收率79.1%为最佳摩尔比。

3 结论与展望

本研究是通过有机合成与生物催化技术的交叉结合与集成，改进医药化学品盐酸甲氧那明的合成路线，设计和改良了一种利用化学酶法合成盐酸甲氧那明的新工艺，2-甲氧基苯乙酸为初始原料，经还原、酶催化、羟氨基化制备盐酸甲氧那明。对酶催化工艺中反应温度、反应pH、辅酶NAD用量，2-甲氧基苯基异丙醇浓度投酶量等因素进行了考察。对羟氨基化制备中，三乙胺、对甲苯磺酰氯、对甲苯磺酸、甲胺乙醇溶液的摩尔投料比进行优化。通过实验得到了较优的工艺路线，制备步骤进一步简化，有机溶剂及试剂使用量少，三废排量少，收率高，具有良好的工业生产前景。生物催化必将为有机合成技术的发展、应用提供更多技术、产品及产业机会。