Wnt信号通路抑制对急性白血病天门冬酰胺酶耐药性的影响

高晓艳，刘梅，田小清，吕润林，鲁英娟

(1.榆林市第二医院血液内科，陕西 榆林 719000；2.空军军医大学第一附属医院血液内科，陕西 西安 710032)

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是骨髓中异常的髓系原始细胞大量增殖并抑制正常造血而形成的白血病分型，在分子生物学、形态学、细胞遗传学上有着极大的异质性[1]。ALL的病因非常复杂，染色体异常和可重现性的基因异常是ALL患者发病的主要机制，表观遗传学调控也是ALL的重要发病机制[2-3]。天门冬酰胺酶(Asp)治疗ALL有一定的疗效，但是随着药物的大量使用与其他因素的影响，ALL患者Asp耐药性情况越来越多，已经严重影响到了患者的治疗与预后效果[4-5]。Wnt信号通路是在肿瘤的发展过程中发挥着重要调节作用的信号转导系统，Wnt信号通路被认为是肿瘤发生发展的重要机制[6]。在ALL的发生发展过程中，激活Wnt信号通路可能导致肿瘤细胞的增殖、转移和复发，从而也为可为ALL的治疗提供新的思路[7-8]。本文具体探讨了Wnt信号通路抑制对ALL Asp耐药性的影响，希望为明确ALL Asp耐药的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人ALL细胞株THP-1购自中科院武汉细胞库，DMEM细胞培养购自美国Gibco公司；脂质体LipofectamineTM3000、Annexin V-FITC PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；MTT增殖检测试剂盒购于美国Promega公司；兔抗人一抗购自英国Abcam公司；HRP抗兔二抗购自英国Abcam公司；siRNA阴性对照载体与Wnt siRNA载体由本实验室保存(构建方法：先找靶基因干扰序列Wnt siRNA，然后是做它的反义链Wnt，后面加T6结构，中间用loop环连接，在两端加上酶切位点)；Asp购自美国Sigma公司(用DMSO配成1.0 mM，4 ℃保存)。

1.2 细胞分组与处理

在含10.0%胎牛血清的DMEM培养基中培养THP-1细胞，培养箱的环境是37 ℃、5% CO2。将细胞分为3组：对照组、Asp组与si-Wnt组。Asp组与si-Wnt组分别转染siRNA阴性对照载体与Wnt siRNA载体，各2 μg。对照组不进行转染，转染6 h后更换培养基。将转染48 h后的各组单细胞悬液调整浓度为1×105个/mL ，培养于96孔板中。给Asp组与si-Wnt组细胞均加入Asp(终浓度为0.25 μM)进行处理；对照组加生理盐水，每个时间点进行 3个复孔的设置。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期THP-1细胞经胰酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培养基调整细胞浓度至1×105个/mL，培养至相应时间节点时，每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，6 h后终止培养，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后使用酶标仪540 nm波长处检测与计算增殖活性。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期THP-1细胞，调整细胞浓度至1×103个/mL，接种于6孔培养板；培养至相应时间节点时，将细胞采用胰酶消化，1 000 rpm×5 min离心弃上清，加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI双标记后，避光反应15 min，采用流式细胞仪检测凋亡情况。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

调整细胞浓度为1×106个/mL，使用70%乙醇4 ℃重悬固定。PBS离心沉淀去除固定液，将50 μg/mL碘化丙啶PI添加到每毫升细胞悬液，将100 μL染色液添加进去混匀，在4 ℃避光保存，时间为30 min，采用流式细胞仪检测与计算各个细胞周期的比例。

1.6 Western-blot法检测蛋白表达水平

取对数生长期THP-1细胞，胰酶消化后提取细胞的总蛋白，每组取20 μg蛋白跑SDS-PAGE胶，转膜后进行过夜封闭，剪成将对应大小的条带放入含有相应一抗溶液的抗体孵育盒中(稀释比例为1∶1 000)，4 ℃过夜，TBST洗涤后，再将膜置于相应种属的二抗中(稀释比例为1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤后进行ELC显色，检测Wnt、GAPDH、AKT蛋白表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 细胞存活情况比较

Asp加药后24 h、48 h、72 h，si-Wnt组的细胞抑制率高于对照组与Asp组(P<0.05)。对照组在加药后24 h和48 h的细胞抑制率低于Asp组(P<0.05)，而在加药后72 h对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组加药后不同时间点的细胞抑制情况对比

*P<0.05，与空白对照组比较；#P<0.05，与Asp组比较。

2.2 细胞凋亡情况比较

Asp加药后24 h、48 h、72 h，si-Wnt组的细胞凋亡率高于对照组与Asp组(P<0.05)，且Asp组高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 3组加药后不同时间点的细胞凋亡情况对比

*P<0.05，与空白对照组比较；#P<0.05，与Asp组比较。

2.3 细胞周期情况对比

Asp加药后72 h，si-Wnt组的G2/M期细胞比例高于对照组与Asp组(P<0.05)，Asp组高于对照组(P<0.05)。si-Wnt组G0/G1期细胞比例低于对照组与Asp组(P<0.05)，Asp组和对照组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。3组间，S期细胞比例对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组加药后72 h的细胞周期情况对比

*P<0.05，与空白对照组比较；#P<0.05，与Asp组比较。

2.4 Wnt、AKT蛋白表达对比

Asp加药后72 h，si-Wnt组中Wnt及AKT蛋白相对表达均低于对照组与Asp组(P<0.05)，Asp组和对照组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组加药后72 h的Wnt、AKT蛋白相对表达水平对比

*P<0.05，与空白对照组比较；#P<0.05，与Asp组比较。

3 讨论

当前我国白血病的发病率逐年上升趋势，死亡人数也逐年增多。ALL是白血病的常见类型，多发病于成年人。虽然临床上治疗ALL的药物比较多，但是治疗效果均较差，五年生存率很难超过40 %。为了改善ALL患者的预后，深入研究ALL的发病与治疗机制具有重要的价值[9]。

天门冬酰胺酶对ALL和急性单核细胞白血病有一定疗效，在临床上也应用于治疗恶性淋巴瘤。该药能将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨，使得白血病细胞既不能从血中取得足够门冬酰胺，也不能自身合成，从而抑制白血病细胞的增殖，促使其凋亡[10]。但是随着天门冬酰胺酶的广泛使用，天门冬酰胺酶的耐药性越来越高[11]。Wnt信号转导途径是一个复杂的网络，其中包含Wnt配体、Frizzled(FZD)受体、共受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白等组分，在癌症发生、干细胞生长和胚胎发育中起着重要作用[12]。Wnt基因能够编码结构类似的分泌型信号转导蛋白，可参与细胞特异化和组织极化，同时参与成人组织的稳态平衡和有丝分裂、分化等过程。Asp加药后24 h、48 h、72 h可抑制细胞存活，促进细胞凋亡，而Wnt通路抑制更能进一步促进Asp导致的细胞存活抑制及细胞凋亡。这表明Asp对白血病细胞具有一定的杀伤作用，但是Wnt通路抑制可以促进这种杀伤作用。

ALL发生的确切机制目前仍尚未完全清楚，不过也是一个多基因、多阶段的疾病，其病理改变涉及代谢酶、炎症、细胞周期、细胞凋亡的变化。有研究[13]显示在白血病细胞株中外源性过表达Wnt可以在体外有效的抑制白血病细胞的增殖，抑制白血病的发展。还有研究[14]表明Wnt过表达可以通过抑制下游靶基因介导膀胱癌细胞G1期阻滞，从而促使细胞生长受阻，还能抑制膀胱癌细胞的迁移和浸润能力。Wnt受体结合可以刺激胞内信号转导，进而促进β-catenin的核易位与稳态。静息状态下，β-catenin与Axin、APC等形成β-catenin降解复合物，此时β-catenin被激酶激活成磷酸化状况，导致其泛素化降解，从而使途径激活。本研究显示Asp加药后72 h，G2/M期细胞比例增多，G0/G1期细胞比例降低，Wnt通路抑制可进一步促进这种现象。这提示Asp可能导致DNA损伤，使细胞周期阻滞，防止受损的的DNA进入有丝分裂，对白血病细胞的生长具有抑制作用。而Wnt信号通路抑制可进一步促进此过程，表示Wnt信号抑制可促进Asp导致的细胞周期阻滞，抑制细胞生长。

Wnt信号通路与恶性肿瘤细胞的增殖分化、血管生长、浸润转移有密切关系。特别是Wnt表达量增加可导致Notch途径被DNA损伤应答激活，进而导致正常细胞的肿瘤转化。本研究显示Asp加药后72 h可显著降低Wnt及AKT蛋白表达，而Wnt信号通路抑制可进一步促进Asp对Wnt及AKT蛋白表达的抑制作用。由此推测，Wnt信号通路抑制可通过间接下调AKT信号传导实现对ALL细胞的杀伤作用。当前也有研究显示过表达Wnt能促进白血病细胞凋亡和分化，抑制细胞转移，可能通过激活线粒体通路来诱导细胞凋亡[15]。本研究也有一定的不足，Wnt信号通路的具体作用机制还不明确，其在ALL中的明确靶基因还不清楚，将在后续研究中深入分析；且本研究没有进行体内实验分析，可能有一定的研究结论偏倚，也需要进一步加强分析。

总之，Wnt信号通路抑制可降低ALL细胞对Asp的耐药性，抑制AKT蛋白的表达，阻滞细胞周期，促进ALL细胞的凋亡，抑制其增殖。