七氟醚对脓毒症大鼠肝损伤的保护作用及其作用机制研究*

石小龙，杜 睿，秦革萍，薛华燕，张宏鑫

脓毒症是机体出现重大损伤感染后出现的一系列复杂的临床病症，是重症监护病房（ICU）常遇到的疾病[1]。随着脓毒症病情的发展，机体各个脏器会受到不同程度的损伤，肝脏是脓毒症最容易损伤的器官。如果肝功能不全患者发生脓毒症会进一步发展为多脏器功能衰竭，威胁患者生命[2]。目前，对脓毒血症发病机制的研究还在继续。新型吸入麻醉药七氟醚，化学名为氟甲基-六氟-异丙基醚，已被广泛应用于手术麻醉。有报道称，应用七氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，但是七氟醚对脓毒症的影响却鲜见报道[3-5]。本研究制备脓毒症肝损伤大鼠模型，探讨了七氟醚对脓毒症肝损伤大鼠肝功能的影响，为临床广泛应用七氟醚麻醉提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器 60只SPF级健康雄性成年SD大鼠，体质量为220±30 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。检测血清ALT、AST、TBIL试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗-actin抗体、抗淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）和抗巨噬细胞1抗原（macrophage-1 antigen，Mac-1）抗体（Abcam）。BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime Biotechnology）。多功能酶标仪（Thermo Scientific MultiSkan Go），电泳仪电源（Tanon），相差显微镜（Leica）。

1.2 脓毒症大鼠模型制备 将60只SD大鼠随机分为假手术组、脓毒症组和七氟醚组。假手术组大鼠只进行开关腹缝合手术；在脓毒症组，采取盲肠结扎穿孔（CLP）法建立脓毒症动物模型；在七氟醚组，将大鼠置于密闭容器内，一端连接麻醉机，另一端连接麻醉机检测仪，以3 L/min的速度输送七氟醚。当仪器显示七氟醚浓度达到2%后，将大鼠放入并维持30 min，再行CLP法建立脓毒症动物模型。术前2 h，给予戊巴比妥钠100 mg·kg-1腹腔注射麻醉，仰卧位固定。颈、腹部备皮，颈部埋针用于输液，以改良的CLP法制备大鼠脓毒症模型，其具体的操作步骤为：在下腹部正中位置切开约2 cm的切口，找到盲肠，并结扎盲肠根部，采用自制穿孔针在距盲肠末端1cm处戳孔，孔径约0.5 cm，挤出粪便，结扎离断双侧大网膜，采用弯针缝合腹腔。术后，立即皮下注射乳酸钠林格液50 ml·kg-1调节体液、电解质和酸碱平衡，所有大鼠经静脉给予营养支持（蛋白质含量为22.4%，脂肪含量为11.8%，碳水化合物含量为65.8%）。建立模型成功的标准：达到动物全身炎性反应综合征的参照标准[6]，且经组织病理学观察可见脓毒性肝脏损伤。造模给药结束后，处死大鼠，取肝组织，行病理学检查。

1.3 血生化指标检测 自右侧颈外静脉采血1 ml，3000 r/m离心，取血清，检测。

1.4 肝组织LFA-1和MAC-1蛋白表达检测 采用Western blot法，取肝组织，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，低温离心机4℃、12000 r/m离心10 min，收集上清液并转移至新的EP管中，采用BCA试剂盒行蛋白定量。取蛋白样品，用PBS稀释，加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，自然冷却。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜。配制5%脱脂奶粉，搅拌均匀，封闭PVDF膜1 h，加一抗，4℃过夜。次日，洗去非特异性结合的抗体，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，用TPBS洗涤3次。采用ECL显色法，在暗室中加胶片曝光，扫描，应用Image J 2X软件进行蛋白条带光密度值分析。

1.5 统计学分析 应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料均服从正态分布，结果以±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较先行方差齐性检验，对方差齐性的资料采用单因素方差分析，对方差不齐的资料采用Kruskal-Wallis检验，当P＜0.05时，表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理学表现情况 在光镜下观察，发现假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝索排列整齐；脓毒症组大鼠肝组织可见有明显的炎性细胞浸润，肝小叶肝索排列紊乱，肝细胞水肿明显；七氟醚组肝组织肝索排列较为整齐，炎性细胞浸润较脓毒症组大鼠明显减少，提示七氟醚对大鼠肝损伤有一定的保护作用（图1）。

图1 各组大鼠肝组织病理学变化情况（HE，200×）

2.2 各组大鼠血生化指标比较 脓毒症组动物血清AST、ALT和 TBIL显著高于假手术组（P＜0.05），而七氟醚组动物血清AST、ALT和TBIL水平较脓毒症组显著下降（P＜0.05），提示七氟醚对脓毒症引起的肝损伤有一定的保护作用（表1）。

表1 各组大鼠血生化指标（±s）比较

表1 各组大鼠血生化指标（±s）比较

与假手术组比，P＜0.05；与脓毒症组比，P＜0.05

只 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L）假手术组 20 67.7±11.7 45.5±9.4 1.7±0.4脓毒症组 20 156.8±14.7 75.6±7.5 4.5±0.6七氟醚组 20 100.5±7.9 61.5±10.1 3.2±0.5

2.3 各组大鼠肝组织LFA-1和MAC-1蛋白表达情况 经Western blot法检测大鼠肝组织 LFA-1和MAC-1蛋白表达情况发现，假手术组肝组织LFA-1和MAC-1表达均较少，脓毒症组LFA-1和MAC-1蛋白明显增多，而七氟醚组肝组织LFA-1和MAC-1蛋白表达与脓毒症组比明显减弱（P＜0.05，图2，表2），上述结果表明七氟醚通过降低脓毒症肝损伤大鼠肝组织LFA-1和MAC-1表达，从而对肝损伤起到保护作用。

图2 各组大鼠LFA-1和MAC-1蛋白表达情况

表2 各组大鼠肝组织 LFA-1和MAC-1蛋白表达（±s）比较

表2 各组大鼠肝组织 LFA-1和MAC-1蛋白表达（±s）比较

与假手术组比，P＜0.05；与脓毒症组比，P＜0.05

LFA-1 MAC-1假手术组 20 0.2±0.1 0.2±0.1脓毒症组 20 1.2±0.2 1.0±0.2七氟醚组 20 0.7±0.2 0.6±0.1只

3 讨论

脓毒症主要是机体对感染的反应失调而导致危及生命的全身炎症反应性疾病。虽然很早就被人们发现，但是其病理过程复杂，所以具体的发病机制仍不清楚。目前主要的治疗方法是控制感染源、使用抗生素以及其他的辅助疗法，没有针对性的治疗方案[7-9]。七氟醚在临床上被广泛使用。有研究报道，七氟醚对心肌细胞有很好的保护作用，能够明显降低心脏病的发病率和病死率。七氟醚在神经外科手术麻醉中的应用价值也很突出，患者使用七氟醚后苏醒快，术后神经功能评价恢复的时间较早，有利于早发现术后并发症。七氟醚还有对脑血管扩张作用弱的优点，也使其应用更为广泛[10，11]。但是，七氟醚对脓毒症肝损伤的研究较少，为了探讨七氟醚对脓毒症肝损伤是否有保护作用，本实验通过制备脓毒症肝损伤大鼠模型，对七氟醚的作用进行了研究。脓毒症最易导致肝损伤，而肝损伤对机体有很大的危害。所以，我们首先观察了假手术组、脓毒症组和七氟醚组大鼠肝组织病理学变化情况，结果发现七氟醚对大鼠肝组织损伤有一定的保护作用。

LFA-1是白细胞上的重要粘附分子，是衡量炎症反应的重要指标。LFA-1属于β2家族整合蛋白，有α链和β链两个亚单位，分布于白细胞上，参与免疫细胞激活的杀伤效应，还与白细胞的定位、渗出、迁移等有关。已有研究表明，LFA-1介导的信号转导在淋巴细胞增殖、活化、迁移等活动中有重要的作用，并且可产生协同刺激信号，共同影响淋巴细胞的分化和凋亡[12，13]。MAC-1位于白细胞表面，是参与机体防御作用及免疫反应的重要的粘附分子，其粘附过程与白细胞游走渗出到炎症部位有关。因此，MAC-1的粘附功能对炎症的发生具有重要的意义[14]。本研究检测了脓毒症大鼠肝组织LFA-1和MAC-1蛋白的表达情况，结果发现七氟醚有显著的下调LFA-1和MAC-1表达的作用，可能与七氟醚缓解脓毒症造成的炎症反应有关。

LFA-1和Mac-1与它们的对应受体（counterreceptors），如细胞间粘附分子（ICAM-1、ICAM-2）、连接粘附分子（junctional adhesion molecules，JAM-A、JAM-C）和高级糖化端产物（advanced glycation end products，RAGE）受体对中性粒细胞聚集起非常重要的促进作用。这个瀑布过程中潜在的配体特异性结合机制仍然不明[15，16]。多形核白细胞（PMN）从血液循环聚集到感染部位或无菌伤口，表现出很多效应细胞的功能，如吞噬、脱颗粒、释放中性粒细胞细胞外诱导剂（neutrophil extracellular traps，NETs）等，成为机体抵御入侵病原体和组织损伤防御的第一防线。通常，白细胞聚集瀑布是一个多步骤的过程，包括捕获、滚动、慢滚、制动（硬粘附）、粘附加强和扩散、腔内爬行、细胞旁或跨细胞迁徙等。除了选择素介导的捕获和滚动外，两个β2整合素成员，LFA-1和Mac-1以及它们的对应受体在促进接下来的白细胞聚集瀑布过程中发挥关键作用。LFA-1和Mac-1是表达于白细胞表面的α、β异质二聚体的跨膜糖蛋白。除了它们常见的内皮配体ICAM-1 and ICAM-2外，另在内皮细胞表面发现了JAM-A、JAM-C和RAGE也是它们的配体。JAM-A直接与LFA-1而不是与Mac-1发生作用，而JAM-C和RAGE直接与Mac-1而不是LFA-1作用。因此，就PMN聚集而言，必须从生理学的角度才能阐明配体特异性的β2整合素功能[17]。

大量的研究证据表明PMN聚集呈组织和刺激特异性，主要依赖于β2整合素和它们的各种各样的配体的表达和功能发挥。一方面，LFA-1 and Mac-1在不同组织与它们的对应配体呈现出特质的功能，如在肌肉组织，LFA-1和Mac-1功能各异，即LFA-1负责介导初始的粘附，而Mac-1接管后来的腔内爬行。然而，LFA-1-ICAM-1和Mac-1-RAGE合作作用介导创伤诱发的白细胞粘附、爬行和迁徙。在肝窦，Mac-1在PMN粘附和爬行方面占主导，而LFA-1只轻微地影响爬行速率。相反，Mac-1只是通过IL-10选择性地下调内毒素（LPS）诱导的炎症反应，引起整合素非依赖的，CD44依赖的肝内PNM聚集。另一方面，在各种生理刺激下，β2整合素的相同配体可能作用不同。例如，在肌肉微环境中，在IL-1β诱导，而不是MIP-2诱导的PMN爬行过程中需要ICAM-2的协助。JAM-C过表达能通过IL-1β刺激肌肉小静脉PNM粘附和迁徙。这些看似矛盾的观察结果主要是由于组织或刺激特异性的LFA-1或 Mac-1与它们的多种配体之间的相互作用及分子表达和分布主导着血流中内皮内PMN的作用强度、爬行和迁徙速度[18-20]。

本研究发现七氟醚可以通过下调炎症相关因子LFA-1和MAC-1表达对脓毒症造成的肝损伤起到保护作用，而应用七氟醚行各类大型手术的麻醉具有重要的临床意义。