Trx-2在急性坏死性胰腺炎大鼠脊髓组织的表达及褪黑素对其的影响

黄滟添 钟卫一（通讯作者） 梁志海 唐国都

（1.广西医科大学附属民族医院消化内科 广西 南宁 530001；2.广西医科大学第一附属医院消化内科 广西 南宁 530021）

急性坏死性胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）可出现中枢神经系统异常，其发病机制与氧化应激有关。Trx-2是存在于细胞线粒体一种氧化还原蛋白，Trx-2在防止线粒体氧化应激方面具有重要作用[1，2]。本文通过应用外源性褪黑素干预ANP大鼠，观察脊髓组织Trx-2和Trx-2mRNA的表达及脊髓组织病理、氧化应激相关指标，探讨Trx-2在ANP的表达与及褪黑索对脊髓组织保护作用的机制。

1.材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，清洁级，体质量200～250g（由广西医科大学实验动物中心提供）；左旋精氨基酸（Sigma公司）；褪黑素（Sigma公司）；RNAsimpleTolalRNAKit（Tiangen公司）；RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas公司）；SYBRPremixExTaqTM（TaKaRa公司）.兔抗鼠多抗（北京生物合成及生物技术公司）

1.2 方法

1.2.1 分组及造模

72只大鼠按随机表法分成ANP组（A组）、褪黑素组（M组）和对照组（C组），每组24只.模型建立：各组大鼠实验前禁食12h.自由饮水；A组和M组腹腔注射6%左旋精氨基酸25mL/kg体质量3次，诱发ANP；M组在首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射0.25%褪黑素20mL／kg体质量，而A组首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射生理盐水20mL／kg体质量；C组则腹腔注射等容积生理盐水。末次腹腔注射后6、12、24h按时点处死大鼠.留取动脉血，胰腺和颈段脊髓组织标本.

1.2.2 胰腺和脊髓病理学检查

胰腺和脊髓组织常规固定、石蜡包埋、切片及HE染色.光镜下观察大鼠胰腺和脊髓病理，胰腺病理参考Kusske等[3]的标准评分.

1.2.3 脊髓组织MDA、MPO和血清MDA的测定

制备脊髓组织匀浆和血清标本，采用微量MDA试剂盒和MPO试剂盒（南京建成生物工程研究所），操作按说明书。

1.2.4 免疫组织化学检测脊髓组织Trx-2表达

采用Elivison二步法检测脊髓组织Trx-2表达。兔抗鼠多抗工作浓度1：200；生物素化羊抗兔二抗来自即用型免疫组化Elivisionplus广谱试剂盒。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知表达Trx-2的乳腺癌组织作为阳性对照。应用Leica图像分析系统进行定量灰度扫描，求出给定面积内的灰度值。

1.2.5 RT-PCR检测脊髓组织Trx-2mRNA的表达

取脊髓组织各约50mg，用RNAsimpleTolalRNAKit提取总RNA，以RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit逆转录成cDNA，采用SYBRPremixExTaqTM荧光实时定量PCR扩增目的片段.据GenBank中的基因序列自行设计引物，Trx-2mRNA引物，Sense：5'TGGGCTTCCCTCACCTCTAC3'，Anti-Sense：5'GCTGTTTGGCTACCATCTTC3'，产物长度253bp ；β-actin引物，Sense：5'CCCATCTATGAGGGTTACGC3'，Anti-Sense：5'TTTAATGTCACGCACGATTTC3'，产物长度150bp.反应条件为：94℃30s；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40个循环；最后72℃2min最后融解曲线分析从56℃起，每增0.5℃进行读板，直到94℃.每次扩增设无cDNA的阴性对照.在I-CyclerIQ型实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）上扩增并分析结果（样品的Trx-2mRNA表达值=Trx-2mRNA起始拷贝数/β-actin起始拷贝数）.

1.2.6 统计学处理

应用SPSSl6.0统计分析软件进行统计分析。行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 胰腺组织病理分值（表1）

2.2 脊髓组织病理

C组脊髓大体未见明显异常，光镜下脊髓神经元胞体丰满，与周围组织连接紧密，胞膜无皱缩，细胞浆、细胞核染色正常.A组脊髓大体见轻度肿胀，光镜下部分脊髓神经元胞体胀大，细胞均质浓染，脊髓组织少数区域溶解，形成空白区，炎细胞侵润明显，24时点明显。M组大体改变同C组，镜下脊髓组织损伤轻，仅部分神经元神经元胞体稍胀大，少量炎细胞侵润。

2.3 大鼠脊髓组织MDA、MPO和血清MDA、Trx-2等各项指标的变化（表1）。

表1 3组大鼠脊髓组织MDA、MPO和血清MDA的变化各项指标的比较（mean±SD）

3.讨论

Trx是一个广泛分布的氧化还原蛋白，通过其活性中心可逆地催化许多氧化还原反应，参与氧化应激的调节，目前发现的Trx有多种，最为重要的是Trx-1和Trx-2。Trx-1是一种内生抗氧化物，在胞质通过直接清除活性氧而发挥抗氧化作用，在胞核通过抑制ikB-α的磷酸化，遏制NF-kB的活化，减少致炎细胞因子的表达，发挥间接抗炎、抗氧化作用[5]。Ritz等[6]认为，Trx-2可相当于Trx-1，在氧化应激条件下，可以作为一个备份系统。最近研究揭示，线粒体在细胞凋亡信号转导中发挥关键作用，而Trx-2在参与线粒体介导的凋亡途径和防止线粒体氧化应激方面，比Trx-1更具重要作用[2]。

褪黑素具有较强的抗氧化活性，对氧化应激的器官具有保护作用。褪黑素分子能跨越任何形态的屏障进入任何细胞而不受特定细胞间的分布限制。褪黑素能减轻多种物质诱导的多种组织的氧化应激反应[7]。

本实验结果显示，ANP大鼠胰腺组织的Trx-2mRNA的表达较对照组显著增高，外源性给予褪黑素干预可胰腺和脊髓组织提高胰腺组织的抗氧化能力，减轻胰腺和脊髓组织的损伤，Trx-2在氧化应激条件下，作为一个备份系统，Trx-2mRNA的表达水平因此而降低。