丝裂原活化蛋白激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激活剂3在膀胱癌中的表达及其临床意义

邓雷弘，徐芳华，曾 涛，徐想达，巢海潮

1南昌大学研究生院医学部，南昌 330006 江西省人民医院 2病理科 3泌尿外科 4临床医学研究所，南昌 330006

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，位居全部恶性肿瘤第8位，具有易复发、易进展、预后差等临床特点[1]。在我国，其发病率高居泌尿生殖系肿瘤首位，并呈逐年上升趋势，已成为一个严重危害公民健康的重大疾病[2]。目前，膀胱癌的发病机制仍不明确[3]，缺乏特异性的早期筛选、诊断指标及有效治疗靶点，使得虽然临床诊疗水平在不断提高，但其5年生存率无明显改观。因此，探索新的诊断、预后标志物及基因治疗靶点一直是相关领域的研究热点。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激活剂3(late endosomal/lysosomal adaptor，MAPK and MTOR activator 3，LAMTOR3)是诸多信号通路的关键调控因子，在细胞生长、增殖及凋亡等生物学行为方面发挥了重要作用[4]。近期研究发现，LAMTOR3与多种肿瘤的发生和发展密切相关[5]，但目前鲜有与膀胱癌相关的报道。本研究拟通过检索基因芯片数据库挖掘信息，并结合细胞实验及临床组织标本进行验证，分析LAMTOR3在膀胱癌中的表达及其临床意义，为其相关基础研究及临床应用提供切入点，为基因芯片数据信息挖掘及应用提供思路。

材料和方法

基因芯片数据筛选Oncomine数据库(http：//www.Oncomine.org/)是基于肿瘤基因芯片数据构建的在线数据分析平台，收录了多种肿瘤的转录组数据及临床相关信息[6]。Expression Atlas 数据库(http：//www.ebi.ac.uk/gxa/home)是一种开放的科学资源，可提供不同组织、细胞类型，生物各发育阶段和疾病转归等相关的基因表达信息[7]。本研究以“LAMTOR3/MP1”和“bladder cancer”为关键词，检索了Oncomine和Expression Atlas数据库，根据检索相关基因表达谱芯片信息，对不同细胞、组织类型，各临床分期、病理分级等相关的大数据进行二次分析。

标本来源2010年1月至2017年12月在江西省人民医院收治的行膀胱癌根治术患者的病理石蜡标本63例，新鲜的膀胱癌组织及其配对的正常组织8对。63例患者中，男57例，女6例，平均年龄(63.4±7.5)岁(43.2～65.9岁)。所有纳入患者的临床资料完备，均经常规组织病理学确诊为膀胱癌，术前均未行放疗、膀胱化学灌注、免疫因子等治疗。组织临床分期、病理学分级分别参照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)2002年TMN分期、世界卫生组织(World Health Organization，WHO)病理分级标准进行。本研究经江西省人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书(伦理批号2018040)。

材料和试剂人源性膀胱癌细胞株UMUC3、J82、5637、T24及人源性正常膀胱永生化细胞SV-HUC-1均购自中国科学院细胞库，其中J82于含10% 胎牛血清的MEM(Gibco，USA)高糖培养基中培养，余细胞株于含10% 胎牛血清的RPMI 1640(Gibco，USA)培养基中培养，培养条件：37℃、5% CO2、饱和湿度。RNA提取试剂盒及2×EasyTaq PCR Super Mix购自北京全式金生物公司，LAMTOR3及GAPDH内参引物购自北京擎科新业生物技术有限公司；兔抗人LAMTOR3及鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国Gene Tex试剂公司，羊抗兔二抗购自北京康为世纪公司，Pro-light HRP化学发光检测试剂购自天根生化科技有限公司，DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物公司。

RT-PCR法检测LAMTOR3 mRNA表达采用RNA提取试剂盒提取组织及细胞总RNA，紫外分光光度计法定量。按试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA。引物序列：LAMTOR3上游引物序列为5’-ATGGCGGATGACCTAAAGCG-3’，下游引物序列为5’-GAAACTTCCACAACTTGTCTCAGTTC-3’；GAPDH上游引物序列为5’-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’；下游引物序列为5’-GGTCAT GAGTCCTTCCACGAT-3’。以cDNA为模板进行PCR扩增，程序设定：预变性95℃ 30 s；循环参数95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 min，35个循环；72℃延伸10 min。设置3次平行实验。

Western blot检测LAMTOR3蛋白水平收集膀胱癌组织及正常膀胱组织，加入裂解液充分裂解，制备细胞总蛋白，BCA法测定各蛋白浓度。配置相应浓度的SDS-PAGE电泳凝胶，依次进行电泳、转膜、10%脱脂牛奶封闭。一抗孵育，4℃摇床过夜；第2天回收一抗后加入二抗孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min；ECL法显影，重复3次实验。采用Image J软件分析各条带灰度值，分别计算目的蛋白的相对表达量并使用Adobe Illustrator软件作图。

免疫组织化学法使用石蜡标本制作4 μm切片。按免疫组织化学SP法试剂盒说明书进行实验：将切片依次经过烤片、水化、高温高压抗原修复、羊血清封闭，稀释一抗(1∶200)室温孵育1 h，PBS洗涤再行二抗室温孵育15 min，苏木精复染，中性树胶封片镜检；采用等量PBS代替一抗为阴性对照。切片染色完成后进行结果判定。

结 果

LAMTOR3在各膀胱癌细胞株中的表达Expression Atlas数据库检索结果显示，LAMTOR3在20株膀胱癌细胞中的基础表达水平存在差异，其中，以Hs 172.T、HT-1376、RT4、JMSU-1、T24细胞株中呈较高表达(图1)。

LAMTOR3在膀胱癌组织及正常组织中的表达Oncomine数据库中Dyrskjøt等[8]报道的基因芯片数据显示：LAMTOR3在浸润性(t=2.857，P=0.005)及非浸润性膀胱癌组织(t=3.105，P=0.003)中的表达均明显高于正常膀胱组织，LAMTOR3在病理分级越高的膀胱癌组织中表达越高(P<0.05)。Sanchez-Carbayo等[9]报道的基因芯片数据显示：LAMTOR3在浸润性膀胱癌组织的表达明显高于正常膀胱组织(t=3.766，P=0.00021)，但在非浸润性癌组织中的表达与正常组织差异无统计学意义(t=-1.001，P=0.81)，LAMTOR3表达水平与膀胱癌病理分级有关(P<0.05)，病理分级越高，LAMTOR3表达越高(图2)。

LAMTOR3：丝裂原活化蛋白激酶和雷帕霉素靶蛋白激活剂3；TPM：每百万映射读取的转录组数
LAMTOR3：late endosomal/lysosomal adaptor，mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 3；TPM：transcripts per million reads
图1LAMTOR3在各膀胱癌细胞系中的表达(颜色越深，表达越高)
Fig1Expression of LAMTOR3 in bladder cancer cell lines in Expression Atlas(deeper color indicates higher expression level)

LAMTOR3 mRNA/蛋白在膀胱癌细胞及组织中的表达RT-PCR检测结果显示：LAMTOR3 mRNA在膀胱癌细胞株UMUC3(t=10.84，P=0.0084)、J82(t=21.75，P=0.0021)、5637(t=45.88，P=0.0005)和T24(t=87.58，P=0.0001)中的表达明显高于正常人膀胱永生化细胞SV-HUC-1(图3A)。在8对配对的膀胱癌组织和正常膀胱组织中，LAMTOR3 mRNA在膀胱癌组织中的表达明显高于正常组织(t=9.076，P=0.0008；t=17.550，P<0.0001；t=7.792，P=0.0014；t=27.460，P<0.0001；t=32.510，P<0.0001；t=35.110，P<0.0001；t=13.990，P<0.0001；t=20.600，P<0.0001)(图3B)。Western blot检测结果显示：LAMTOR3蛋白水平在癌组织中的表达也明显高于正常组织(t=20.560，P<0.0001；t=32.510，P<0.0001；t=30.620，P<0.0001；t=4.865，P=0.0082；t=8.129，P=0.0012；t=19.600，P<0.0001；t=13.030，P=0.0002；t=13.970，P<0.0001)(图3C)。

LAMTOR3的表达与膀胱癌临床病理特征的关系免疫组织化学检测结果显示：LAMTOR3蛋白主要定位于胞浆，染色呈棕褐色，在正常膀胱组织中低表达，在癌组织中高表达；在浸润性癌组织中较非浸润性癌组织高表达(图4)；其表达水平与膀胱癌临床分期(χ2=9.189，P=0.002)、病理分级(χ2=4.746，P=0.029)和淋巴结转移(χ2=6.210，P=0.013)密切相关，但与性别(χ2=0.965，P=0.326)、年龄(χ2=2.126，P=0.145)、远处转移(χ2=1.261，P=0.261)等无明显相关性(表1)。

与正常膀胱组织相比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001 compared with the normal group
图2LAMTOR3在Oncomine数据库基因芯片中的表达水平
Fig2Expression level of LAMTOR3 in Oncomine database

Mr：相对分子质量；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
A.RT-PCR检测LAMTOR3 mRNA在各膀胱癌细胞株及膀胱永生化细胞的表达；B.RT-PCR检测LAMTOR3 mRNA在8对配对的膀胱癌(T)和癌旁组织(N)中的表达；C.Western blotting检测8对配对的膀胱癌组织(T)和相邻的非癌组织(N)中LAMTOR3蛋白表达，以β-actin为内参对照
A.RT-PCR was used to detect the expression of LAMTOR3 mRNA in bladder cancer cell lines and bladder immortalized cells；B.RT-PCR was used to detect the expression of LAMTOR3 mRNA in eight paired bladder cancer(T)and paracancerous tissues(N)；C.Western blotting was used to detect the expression of LAMTOR3 protein in eight pairs of bladder cancer tissues(T)and adjacent non-cancer tissues(N)，with β-actin as the internal reference
图3LAMTOR3 mRNA/蛋白在膀胱癌细胞及组织中的表达
Fig3Expressions of LAMTOR3 mRNA/protein in bladder cancer cells and tissues

图4LAMTOR3分别在正常膀胱组织、非浸润性及浸润性膀胱癌组织中的表达(HE)
Fig4Expression of LAMTOR3 in normal bladder tissues，non-invasive，and invasive bladder cancer tissue(HE)

讨 论

LAMTOR3别名MP1，定位于人染色体4q22.3，是蛋白编码基因，其编码的为支架蛋白，由124个氨基酸组成，相对分子质量约为13 623，该支架蛋白主要以蛋白复合体的方式定位于有丝分裂后期的细胞核上，通过MAPK1/胞外信号调节激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2)，以及MAPK激酶MAP2K1/MEK1等，调节MAPK信号转导通路，参与细胞有丝分裂和生长过程[4]。有研究发现，LAMTOR3作为调控因子促进细胞增殖、迁移和凋亡[10]，在肺癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]、胰腺癌[14]等多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关[5]。有学者发现，LAMTOR3参与了雌激素依赖的乳腺癌细胞的发生发展过程，对雌激素受体阳性乳腺癌细胞系的存活至关重要[12]。Jun等[14]研究发现，LAMTOR3可调节癌细胞内的生长因素、氧水平、细胞内能量和氨基酸含量等，诱导胰腺癌细胞迅速增殖，说明LOMTOR3在肿瘤的生长存活及增殖方面发挥了重要的调控作用。同时有研究表明，LOMTOR3还与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。Park 等[15]研究证实，LOMTOR3可调节肿瘤迁移关键因子p21激活激酶(p21 activated kinases，PAK)[16]，从而抑制前列腺癌细胞DU145的迁移。Kwon等[17]研究发现，LOMTOR3通过驱动ERK1/2活性提高胶质瘤肿瘤干细胞的侵袭力，并证实其表达与脑肿瘤的不良预后密切相关，提示LAMTOR3和肿瘤的生长、侵袭、转移、预后等关系密切，为肿瘤的诊断和治疗提供新的可能。2007年，Araujo等[18]首次提出将LOMTOR3用于乳腺癌的诊断和靶向治疗。此外，最近研究报道LAMTOR3高表达可增加肿瘤对放疗、化疗的抗性；敲除LAMTOR3基因后，肺癌细胞对化疗敏感性明显增加[11]。以上研究说明，LAMTOR3可能是一个潜在的肿瘤调控因子，在肿瘤的发生、发展过程中发挥了关键作用。

表1 膀胱癌组织中LAMTOR3的表达与临床病理特征的相关性Table 1 Correlations between LAMTOR3 and clinicopathological characteristics in bladder cancer patients

LAMTOR3：丝裂原活化蛋白激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激活剂3
LAMTOR3：late endosomal/lysosomal adaptor，mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 3

本研究检索了Oncomine和Expression Atlas数据库，挖掘了LAMTOR3表达相关的基因芯片数据，分析LAMTOR3在膀胱癌细胞及组织中的表达，及其与膀胱癌临床病理特征的关系。Expression Atlas数据库检索结果显示，LAMTOR3在20株膀胱癌细胞中表达存在差异，以Hs172.T、HT-1376、RT4、JMSU-1、T24细胞株中表达较高，提示LAMTOR3和膀胱癌细胞密切相关。Oncomine数据库检索结果显示，LAMTOR3在膀胱癌组织中的表达明显高于正常膀胱组织，其表达水平和膀胱癌病理分级相关，提示LAMTOR3在膀胱癌发生、发展过程中可能扮演了重要的调控角色。

为进一步验证基因芯片数据结果，本研究体外培养膀胱癌细胞株及收集行膀胱癌根治术患者的病理石蜡标本63例，以及新鲜的膀胱癌组织及其配对的正常组织8对，分别采用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学法检测LAMTOR3的表达。结果显示，LAMTOR3 mRNA在膀胱癌细胞株中的表达明显高于正常细胞株，LAMTOR3基因/蛋白在膀胱癌组织中明显高于正常组织，LAMTOR3蛋白主要定位于胞浆，染色呈棕褐色，在正常膀胱组织中低表达，在癌组织中高表达，在浸润性癌组织中较非浸润性癌组织高表达，其表达水平与膀胱癌临床分期、病理分级、淋巴结转移密切相关，但与性别、年龄、远处转移等无明显相关性，与生物信息学相关分析结果一致，提示LAMTOR3和膀胱癌关系密切。

综上，本研究根据生物信息分析并结合细胞、组织标本水平验证，评估了LAMTOR3在膀胱癌中的表达及其临床意义，结果提示LAMTOR3在膀胱癌细胞及组织中高表达，与膀胱癌发生发展密切相关，为其相关基础研究及靶向分子治疗提供新的切入点，为基因芯片数据信息挖掘及应用提供了思路。