正交试验法优选身痛逐瘀汤颗粒的提取工艺

周维利，公为红，王 坤

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

身痛逐瘀汤是清代名医王清任《医林改错》[1]中的五大逐瘀汤之一，己入选国家中医药管理局公布的第一批100种古代经典名方目录[2]，原文记载，“凡肩痛、臂痛、腰痛、腿痛，或周身疼痛，总名曰痹症。明知受风寒，用温热发散药不愈；明知有湿热，用利湿降火药无功。久而肌肉消瘦，议论阴亏，随用滋阴药又不效。至此便云：病在皮脉，易于为功；病在筋骨，实难见效。因不思风寒湿热入皮肤，何处作痛。入于气管，痛必流走；入于血管，痛不移处。如论虚弱，是因病而致虚，非因虚而致病。……古方颇多，如古方治之不效，用身痛逐瘀汤”。组方为白秦艽一钱，川芎二钱，桃仁三钱，红花三钱，甘草二钱，羌活一钱，没药二钱，当归三钱，灵脂二钱（炒），香附一钱，牛膝三钱，地龙二钱（去土），水煎服。据学者邱隆等[3-6]考证，清代1两约合37.3 g，每处方折合现代剂量约92.5 g，适宜成颗粒剂，便于患者服用。

身痛逐瘀汤颗粒至今未见有关制剂提取方面报道，本实验以川芎和当归中阿魏酸和红花中的羟基红花黄色素A含量为评价指标，对提取工艺进行了优化，现报道如下。

1 仪器与材料

仪器：FA1204C电子分析天平（上海天美天平仪器有限公司），高效液相色谱仪（日本岛津），LC-15C泵，SPD-15C检测器，岛津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

对照品：阿魏酸（10 mg，110773-201614）；羟基红花黄色素A（10 mg，111637-201609）圴购自中国食品药品检定研究院。

试剂：乙腈、甲醇和磷酸为均为色谱纯，水为重蒸去离子水，其余试剂均为分析纯。

药材：均购自济南漱玉平民大药房有限公司。

2 方法与结果

2.1 水提正交试验设计

分别按身痛逐瘀汤颗粒处方称取白秦艽18.5 g，川芎37 g，桃仁55.5 g，红花55.5 g，甘草37 g，羌活18.5 g，没药37 g，当归55.5 g，灵脂（炒）37 g，香附18.5 g，牛膝55.5 g，地龙（去土）37 g，共9份，每份计462.5 g，参考相关文献[7-9]，选取加水量、提取次数与时间3个因素，每个因素3个水平，进行L9(34)试验，以提取液中阿魏酸和羟基红花黄色素A含量为指标进行评价，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 阿魏酸和羟基红花黄色素A含量测定[10-11]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：岛津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相（A）乙腈-0.05 %磷酸（B）递度洗脱，检测波长0～15 min，210 nm；15～100 min，290 nm；50～50 min，254 nm，流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl，递度洗脱系统见表2。

表2 梯度洗脱系统

2.2.2 对照品溶液制备 分别精密称取阿魏酸和羟基红花黄色素A对照品适量，置入棕色量瓶，加50 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸8 µg和羟基红花黄色素A 100 µg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 精密移取提取液10 ml，水浴蒸至近干，加50 %甲醇20 ml，分次转移至25 ml量瓶，超声处理（功率200 W，频率50 kHz）30 min，冷却至室温，加50 %甲醇至刻度，取续滤液即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备 按身痛逐瘀汤颗粒提取方法制备阴性提取液，方法同2.2.3项，得阴性样品溶液。

2.2.5 线性与范围 取阿魏酸和羟基红花黄色素A对照品溶液，注入高效液相色谱仪，以浓度C（µg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，阿魏酸回归方程为A=398 301C-206 698，R2=0.9996；在1.516～13.644 µg/ml浓度范围内，阿魏酸峰面积值与浓度具有良好线性关系；羟基红花黄色素A回归方程为A=550 306C-272 081，R2=0.9997；在20.01～181.26 µg/ml浓度范围内，羟基红花黄色素A峰面积值与浓度具有良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 取阿魏酸对照品溶液（7.58 µg/ml）与羟基红花黄色素A对照品溶液（100.7 µg/ml）分别注入高效液相色谱仪，连续进样6次，峰面积RSD为0.47 %与0.62 %，仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取身痛逐瘀汤颗粒样品6份，按“2.2.3供试品溶液制备”，进行含量测定，计算阿魏酸和羟基红花黄色素A含量RSD，含量RSD为1.56 %与1.31 %，方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一身痛逐瘀汤颗粒溶液分别于0，3，6，9和12 h进样，记录峰面积，计算峰面积积分值的RSD，结果RSD为1.15 %与1.23 %，供试品溶液在12 h内稳定。

2.3 最佳工艺确定

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。以提取液中阿魏酸和羟基红花黄色素A含量为提取评价指标，影响因素大小均为A＞B＞C，因素A2与A3、B2与B3、C2与C3均无明显差别，直观最佳工艺为A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min），综合考虑，优选工艺为A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）。

表3 正交试验设计与结果

表4 羟基红花黄色素A含量方差分析

2.4 工艺验证

称取身痛逐瘀汤颗粒处方中各药材6份，每份462.5 g，分别按A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min）和A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）各提取3次，结果见表5。

表5 提取工艺验证试验结果表

结果表明，直观工艺与优选工艺无明显差异，最终确定提取工艺为药材加7倍量水提取2次，每次60 min，该提取工艺验证3次，阿魏酸和羟基红花黄色素A含量稳定。

3 讨论

3.1 古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定经典名方制剂的制备方法应与古代医籍记载基本一致，为保持经典名方传统医药的特点，结合处方中有效成分的理化性质，选择了水提取法，通过预实验发现药材浸泡24 h后吸水量约为药材的2倍，浸泡时间多于30 min时对提取结果几乎没有影响，为了提高提取效率，药材均浸泡30 min。根据预实验结果，加水量于药材量5倍与多于8倍量药材时，提取效果均不理想。故正交试验提取中加水量6、7、8倍量3个水平进行了正交试验设计优选，并对处方中药材的有效成分阿魏酸和羟基红花黄色素A含量做了测定，优选出了较为合理的提取工艺。

3.2 身痛逐瘀汤颗粒由十二味中药组成，提取液成分复杂且极性跨度大，当归、川芎共同主要成分是阿魏酸，红花主要成分是羟基红花黄色素A，采用梯度洗脱可使检测峰得到良好分离。