宰后牦牛肉水分分布变化与持水性能关系研究

郭兆斌 余群力 陈 骋 韩 玲 孔祥颖 石红梅

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院， 兰州 730070； 2.海北州畜牧兽医科学研究所， 海北 810200； 3.甘南藏族自治州畜牧兽医科学研究所， 甘南 747000)

0 引言

我国牦牛(Bosgrunniens)占世界牦牛总数的95%，其种属和起源不同于任何黄牛、肉牛，是世界三大源种动物之一[1]。牦牛具有很强的适应寒冷高山牧区的能力，其肉质具有高蛋白、低脂肪、矿物质含量高(尤其是铁)的特点。肉的保水性也称作持水力(Water-holding capacity，WHC)，是肉用品质的重要指标之一。我国生产的冷鲜牛肉保水性较低，影响牛肉品质和货架期，据统计，零售冷鲜肉的汁液流失率为1%～3%，每年仅因汁液流失造成企业直接经济损失高达30多亿元[2]。

目前用于测定肉品保水性的常用方法有加压损失法、近红外分析技术、滴水损失法、电导率法等[3]。这些方法表征保水性只能定性反映肉的持水力，而无法表征肉中不同水分群的存在状态及迁移过程。LF-NMR(低场核磁共振)作为一种新型、快速、无损检测技术，是目前研究肌肉中水分分布及迁移最有效的手段之一[4]。通过弛豫信息测定肌肉组织持水性，与常规方法相比具有较高的相关性，相关研究通过测定肉制品的LF-NMR弛豫信息来反映肉宰后保水性的变化，以及不同的冻结、解冻方式对持水性的影响[5]。

文献[6]论述了利用LF-NMR技术研究宰后肌肉中水分的迁移和分布规律，发现肌纤维结构显著影响肌肉中水分分布，肌纤维网络外部的水分与保水性有密切的关系，弛豫时间可反映肉的持水性。文献[7]利用LF-NMR研究了蛋白氧化及解冻方式对牛肉保水性的影响，结果显示，新型解冻方法能减缓解冻过程中肌肉水分状态的改变，从而降低解冻损失，提高解冻牛肉的保水性。文献[8]利用LF-NMR研究了不同处理对酱牛肉保水性的影响，结果表明，超高压处理、加热处理及未处理在贮藏期均会导致产品质量的损失，超高压处理组及加热处理组损失分别为4.36%和6.53%，同时检测到3个明显的水分群，代表肉中的结合水、不易流动水和自由水3种存在状态；核磁成像结果显示第0天时对照组、超高压处理组、加热处理组的图像依次变亮，表明酱牛肉中自由水的含量依次增多。文献[9]利用LF-NMR研究冷却方式对猪肉保水性的影响，结果表明，快速冷却方式可缩短成熟时间，并且提高肉的保水性。

本文以牦牛肉为研究对象，以肉牛为对照，研究牛肉宰后成熟过程中保水性能指标(加压损失、滴水损失、蒸煮损失、肌原纤维蛋白表面疏水性)的变化规律，同时利用LF-NMR技术分析牛肉宰后水分的分布与迁移，及其与保水性能的关系，以期为建立和完善肉品保水性理论及肉产品深加工提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：选取青海百德投资发展有限公司在相同条件下饲喂的发育正常、健康无病、体重相近、年龄在36～48月龄的公牦牛10头，宰前24 h禁食禁水。同时以甘肃康美现代农牧产业集团有限公司饲喂的年龄在36～48月龄的肉牛(西门塔尔牛)为对照。

试验试剂：氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、五水合硫酸铜、四水合酒石酸钾钠、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、氢氧化钠、溴酚蓝等，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PQ-001型低场核磁共振分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；MesoMR23-060H-I型核磁共振成像分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；Eppendorf 5417R型低温台式冷冻离心机，德国Eppendorf生物公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；YYW-2型应变式控制式无侧限压力仪，南京土壤仪器厂有限公司；PHS-2C型pH计，上海雷磁仪器厂；XHF-DY型高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1样品采集和制备

将上述牛进行屠宰，屠宰后取背最长肌(M.Longissimusdorsi，LL)，除去表面结缔组织，采用聚乙烯收缩薄膜单层包裹。每头牛取50 g肉样，用于0 d的样品，现场测定表观持水性(加压损失率、滴水损失率、蒸煮损失率)，将其余背最长肌装入带有冰袋的保温盒带回实验室，分别取成熟到各个时间点(0.5、1、3、5、7 d)的肉样20 g，测定牛肉T2弛豫时间和牛肉核磁共振成像；同时进行表观持水性的测定。

同时取0 d的肉样，以及成熟到0.5、1、3、5、7 d 的样品20 g，放入液氮中迅速冷冻，然后置于实验室-80℃条件下，用于肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein，MP)表面疏水性的测定。

1.3.2加压损失率

参照文献[10]的加压滤纸法测定。取1 cm厚的肉样，在其中央用直径为2.523 cm的取样器(圆面积为5.0 cm2)在不吸水的硬橡胶板上切取肉样、称质量M1，将肉样置于两层医用纱布之间，上、下各垫18层滤纸，置于压缩仪平台上，匀速加压至343 N，保持5 min，撤除压力后立即称肉块质量M2，试验重复进行3次，取其平均值。肉样的加压损失率计算公式为

A=(M1-M2)/M1×100%

(1)

1.3.3滴水损失率

参照文献[11]的方法测定。沿着肌纤维方向取20 g左右的牛背最长肌肉样，将肉样吊于聚氯乙烯袋中并系紧袋口，使肉样不与包装袋接触，并悬挂于0～4℃条件下，成熟到相应的时间点后，取下肉样，用滤纸沥干其表面水分后称量，肉样的滴水损失率计算公式为

B=(W1-W2)/W1×100%

(2)

式中W1——肉样初始质量，g

W2——吊挂后沥干水分的肉样质量，g

1.3.4蒸煮损失率

取50 g左右的肉样放入蒸煮袋密封，记录质量X1，置于80℃的恒温水浴中，待肉样中心温度达到70℃并保持20 min，然后将样本冷却至室温(20℃)，记录质量X2，蒸煮损失率计算公式为

C=(X1-X2)/X1×100%

(3)

1.3.5MP表面疏水性

(1)MP提取

参照文献[12]的方法并稍作修改。具体操作为：将1 g左右的样品搅碎后，加入10倍体积的标准盐溶液(20 mmol/L磷酸钾缓冲液，0.1 mol/L KCl， 2 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH值 6.8)，匀浆(12 000 r/min)15 s，离心(4℃、2 000g)10 min弃上清液，沉淀用8倍体积标准盐溶液溶解后，4℃离心(2 000g)10 min弃上清液，重复两次。沉淀用8倍体积含1% Triton X-100的上述标准盐溶液溶解后，4℃离心(2 000g)10 min弃上清液，重复两次。沉淀用8倍体积100 mmol/L KCl溶液溶解后，4℃离心(2 000g)10 min弃上清液，重复两次。沉淀中加4 mL浓度为100 mmol/L的KCl溶液溶解后，用双缩脉法测定蛋白含量，用牛血清白蛋白做标准曲线。

(2)MP表面疏水性

参照文献[13]方法并稍作修改。具体如下：将上述提取的肌原纤维蛋白溶液用磷酸盐缓冲液调整质量浓度为1 mg/mL，将40 μL 1 mg/mL溴酚蓝溶液(BPB)悬入1 mL的1 mg/mL蛋白溶液，充分混匀，室温涡旋振荡10 min，并离心(4℃、4 000g)15 min。空白对照为1 mL磷酸盐缓冲液加入40 μL的1 mg/mL BPB，其余操作同上。取上清液稀释10倍后在595 nm下测定吸光度。用BPB结合疏水性残基的量作为表面疏水性指数。表面疏水性指数计算公式为

S=40(A1-A2)/A1

(4)

式中S——表面疏水性指数，μg

A1——对照组的吸光度

A2——样品的吸光度

1.3.6牛肉水分分布与迁移

参照文献[14]的方法，使用LF-NMR技术，通过检测肌肉中氢原子核在磁场中的弛豫特性来获得肌肉中水分分布的信息并研究水分流动的规律，具体方案如下：将约2 g样品放入直径12 mm、容积1.5 mL的样品管中，为防止水分蒸发，用封口膜封口，再放入核磁管中进行分析。使用核磁共振分析软件及CPMG序列采集样品T2信号，使用SIRT算法100 000次迭代拟合。T2分布曲线纵坐标信号强度除以相应样品质量得到归一化T2分布曲线。同时进行MRI磁共振成像：使用纽迈核磁共振成像软件及MSE序列进行成像，并用Image-J软件测定样品灰度。核磁共振分析仪参数：频率23 MHz，磁体强度0.5 T，线圈直径为40 mm，磁体温度为32℃。

1.4 数据统计分析

试验结果均采用平均值±标准差表示，数据均平行测定3次，用SPSS 22.0软件进行方差分析，用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 加压损失率

牦牛肉宰后成熟期加压损失率的变化如图1所示。图中不同小写字母表示同一种牛肉在成熟过程中指标差异显著(p<0.05)，**或*表示不同牛种牛肉在每个成熟时间点指标差异极显著(p<0.01)或差异显著(p<0.05)，下同。由图1可知，在1 d之后，除了第5天牦牛肉加压损失率显著高于肉牛(p<0.05)，其余时间点牦牛肉加压损失率极显著高于肉牛(p<0.01)，说明宰后肉牛的保水性高于牦牛。随着时间的递增，加压损失率均呈现先上升后下降的变化趋势，宰后0～3 d加压损失率显著升高(p<0.05)，第3天达到最大值，牦牛和肉牛分别为42.10%和34.01%，比0 d分别增加了28.48、21.32个百分点，3 d后又缓慢下降，并于7 d时降至37.46%和30.37%。加压损失越大即肌肉的WHC持水性越差[15]，肌肉内部大部分保水性蛋白都存在于细胞内部，这些蛋白质对水分有一定的结合能力，在宰后贮藏期细胞内的水分不易流出，但是在加压作用力下，这些水分会从细胞内流出，可以反映出肌肉细胞的保水情况[16]。在加压条件下，氢键通常是比较稳定的，而疏水相互作用会受损，同时对共价键有一定的影响[17]。在肉类组织中，水是包含在肌肉纤维内部和肌纤维之间的，因此，蛋白质基质内外的水分子在蛋白质与水的相互作用中起着重要的作用，直接影响肉样品的WHC。

2.2 滴水损失率

牛肉滴水损失是指畜禽肉仅在重力作用条件下肌肉系统的液体损失，牛肉在贮运、 加工过程中滴水损失现象严重，导致严重的质量损耗，品质劣变，使肉类加工企业经济损失巨大[18-19]。牦牛肉宰后成熟期滴水损失率变化如图2a所示，在第0天牦牛肉滴水损失率极显著(p<0.01)高于肉牛，高出了0.58个百分点；第3天牦牛肉滴水损失率显著高于肉牛(p<0.05)，高出了0.35个百分点，其余时间点无显著性变化。宰后牦牛肉在0.5～3 d滴水损失显著上升，第3天达到最大值，为3.19%，然后显著下降；肉牛在0～3 d滴水损失率显著上升，从0 d的1.38%到第3天达到最大值，为2.84%，然后显著下降，第5天和第7天无显著性差异。滴水损失受很多因素影响，包括肌肉组织的不同处理方式和生化变化等，目前的研究多集中在肌肉组织结构改变、蛋白修饰和变性导致水分通道的变化，最终导致滴水损失的发生[20]。

从图2b可以看出，第3天时pH值达到极限pH值，同时此刻滴水损失率最大，这是因为牦牛宰后肌肉僵直开始，肌肉转变为肉的过程中产生乳酸导致pH值下降[21]，pH值降低至蛋白质等电点(5.3～5.5)后，蛋白质的正负电荷相等，蛋白质相互吸引，静电荷为零，降低了对水分的吸引，蛋白溶解度下降，滴水损失增加，此时水分损失最为严重，保水性最差[22]。同时过低的pH值也会导致储存水分的蛋白质变性、交联，另外肌原纤维之间距离减小，肌节变短，肌纤维空隙面积增大也会造成水分的流失[23]。

图2 牦牛和肉牛肉宰后成熟过程中滴水损失率及pH值Fig.2 Drip loss and pH value of yak meat during postmortem aging

2.3 蒸煮损失率

牛肉蒸煮损失同样是衡量肌肉保水性的重要指标之一，如图3所示，随着宰后成熟时间的增加，牦牛和肉牛背最长肌的蒸煮损失率呈先增大后减小的趋势，并且在整个成熟过程中，两种牛肉的蒸煮损失率无显著性差异。宰后0～3 d两组牛肉蒸煮损失率随成熟时间的增加显著升高(p<0.05)，第3天达到最大值，牦牛和肉牛分别为42.82%和42.01%，比0 d分别增加了12.36、12.91个百分点，3 d后又缓慢下降，并于7 d时降至38.14%和38.99%。整个成熟过程中蒸煮损失率先上升，第3天达到峰值后又下降的现象可能是由于宰后肌肉蛋白质变性，肌肉骨架蛋白逐渐降解，结构被破坏，结合水能力降低，与文献[24]研究结果相似。同时在宰后成熟初期，蒸煮损失率增加也有可能是因为pH值下降诱导肌原纤维网格结构收缩，同时在蒸煮条件下，肌肉蛋白的热变性作用使肌原纤维紧缩，储存不易流动水的空间变小，部分不易流动水态变为自由水而流失[25]。在热加工过程中，保水能力主要与肌原纤维蛋白热变性的程度有关，最初肌原纤维未完全变性，肌纤维产生的压力和张力较小，水分溢出较小，随着蒸煮温度的升高，肌纤维完全变性而产生较大的压力和张力，水分不断溢出，导致蒸煮损失显著增大。

图3 牦牛和肉牛肉宰后成熟过程中蒸煮损失率Fig.3 Cooking loss of yak meat during postmortem aging

2.4 MP表面疏水性指数

蛋白表面疏水性指数反映了蛋白质的水合特性，可以用来评价WHC对MP构象稳定性的影响，蛋白表面疏水性指数越低，结合水能力就越强[26]。牦牛肉宰后成熟过程中MP表面疏水性指数变化如图4所示，在第0.5天和第5天牦牛肉MP表面疏水性指数显著高于肉牛(p<0.05)；第3天牦牛肉MP表面疏水性指数极显著高于肉牛(p<0.01)，高出3.53 μg，其余时间点两种牛无显著性变化。宰后牦牛肉在0～3 d MP表面疏水性指数显著性上升，第3天达到最大值，为24.75 μg，然后显著下降；肉牛在0.5～3 d的MP表面疏水性指数显著性上升，从0.5 d的14.46 μg到第3天达到最大值，为21.22 μg，然后显著下降，第5天和第7天无显著性差异。宰后初期MP表面疏水性指数的增加可能是由于牛肉宰后成熟过程中存在明显的蛋白氧化效应，羰基含量逐渐增大，蛋白氧化使蛋白质发生交联、降解及变性，肌原纤维结构遭到破坏(主要指肌球蛋白和肌动蛋白的降解)，导致非极性氨基酸暴露在蛋白质表面，从而疏水性指数增加，肌肉保水性下降，形成汁液流失，降低肉的营养品质和加工品质，这与文献[27]的结果一致。疏水作用在水体系的分子结构中起着重要的作用，疏水作用的分子基础是大部分水分子的强内聚力，导致疏水基团从水中排出，然而当两个疏水表面从一个比较大的间距开始接触时，自由能将会大幅下降，因此疏水作用对保水性的影响是间接的[28]。

图4 牦牛和肉牛肉宰后成熟过程中MP表面疏水性指数Fig.4 Surface hydrophobicity index of yak meat during postmortem aging

2.5 水分分布与组成

使用SIRT算法100 000次迭代拟合得到样品T2分布曲线。将T2分布曲线纵坐标按样品质量归一化处理得到牛肉样品的T2弛豫图谱。牦牛和肉牛肌肉宰后成熟过程中T2弛豫图谱如图5所示。

图5 牦牛和肉牛肌肉宰后成熟过程中T2弛豫图谱Fig.5 T2 relaxation spectrum of yak and beef cattle muscle during postmortem aging

由图5可知，牦牛和肉牛宰后成熟过程中肌肉的水分均为3种相态：结合水T21(0.01～10 ms)、不易流动水T22(10～100 ms)和自由水T23(>100 ms)。图谱反演后得到牛肉成熟过程中不同水分群的水分含量信息如表1所示。

利用LF-NMR测定水分的T2弛豫信息，可以定量分析肌肉中3种状态水的分布及组成。结合水是一种与蛋白质通过静电引力紧密结合的组分，占肉类样品总水分的1%～5%；不易流动水是存在于有序的肌纤维蛋白基质内部的水分，占总水分的90%以上；自由水是存在胞外能自由流动的水，是汁液流失的来源[29]。从表1可以看出，牛种之间，在成熟第3、5、7天时，牦牛肉P21显著高于肉牛(p<0.05)，其他2个时间点无显著变化；牦牛肉在成熟第3天和第7天时P21显著高于其他3个时间点(p<0.05)，而肉牛P21则是成熟第3天显著高于其他4个时间点(p<0.05)，每1 g蛋白质大约可以紧密吸附0.5 g的结合水[30]，并且结合紧密，并不会发生水分的迁移，因此结合水不是衡量水分迁移的主要水分群。

表1 牦牛肉宰后成熟过程中水分分布及组成Tab.1 Water distribution and composition of yak meat during postmortem aging %

注：同一列不同字母表示不同成熟时间差异显著(p<0.05)；同一行**或*表示不同牛种在相同成熟时间差异极显著(p<0.01)或差异显著(p<0.05)。

整个贮藏期，牦牛肉和肉牛P22的变化趋势几乎一致，均为在第0.5、1、5、7天没有显著的变化，而第3天的P22显著低于第0.5、1、5天的(p<0.05)；牛种之间，牦牛在第3天P22显著低于肉牛的，其他4个时间点无显著变化。第3天牦牛肉和肉牛P22最小，说明此刻有较多的不易流动水转变成了自由水，保水性最差。牦牛肉和肉牛P23在0.5～3 d时呈现升高趋势，第3天达到最大，牦牛为0.32%，肉牛为0.24%，3～5 d时P23下降，5～7 d时P23再次升高；不同牛种之间在5个时间点均无显著变化。因此牦牛肉和肉牛第3天时P23最大，说明保水性在此时最差，持水能力最弱，与P22的变化呈显著的负相关。

宰后早期P22减小，一些研究认为是由低pH值诱导了肌原纤维网状结构收缩而引起胴体(主要指背最长肌)的物理变化所致，3 d后增大可能是因为肌肉在宰后无氧条件下引发的一系列反应，使细胞内通透性增加引起了肌丝空间膨胀，使其吸水能力增强，从而胞内水增加[31-32]。不易流动水和自由水的弛豫时间延长，表明水与蛋白质的相互作用减弱，导致保水性下降，但是不同水分群之间的转化对牛肉WHC的影响大于弛豫时间增加对牛肉WHC的改善[33]。

2.6 水分空间分布

核磁共振成像是通过无损测定样品的氢质子密度图谱而反映样品中水分的空间分布情况。图6、7为牦牛和肉牛背最长肌的氢质子密度图谱，这些图谱中，信号较强(较亮)的区域代表样品中相对自由的水分(不易流动水和自由水)，信号较弱(较暗)的区域代表样品中与蛋白质等大分子紧密结合的水分(结合水)。本研究中测定质子密度成像时，成像层面有7层，样品中间区域信号强度高于表层区域，由于样品并非规则的圆柱型，导致表层成像不规则，因此，核磁共振成像图谱中间区域更具代表性，本研究选择第4层进行分析。根据图6、7通过Image-J软件进行图像分析，计算出图像的灰度，可定量表征样品中的水分含量，如图8所示。

图6 牦牛背最长肌成熟过程中水分空间分布Fig.6 Water spatial distribution during postmortem aging of yak meat

图7 肉牛背最长肌成熟过程中水分空间分布Fig.7 Water spatial distribution during postmortem aging of beef cattle meat

图8 宰后成熟过程中图像灰度的变化Fig.8 Change of grey value during postmortem aging

灰度的高低能直接表征样品水分含量的高低，从图8可以看出，在0.5 d时，牦牛背最长肌核磁成像灰度显著低于肉牛(p<0.05)，其余成熟时间点牦牛灰度极显著低于肉牛(p<0.01)，说明宰后牦牛背最长肌保水性低于肉牛。随着成熟时间的延长，两组牛肉灰度在成熟第5天时达到了最大值，显著高于其他成熟时间点，分别为牦牛145.03、肉牛156.51；宰后初期灰度在第3天时最低，分别为牦牛109.44、肉牛124.02，说明两组牛肉宰后成熟到第3天时肉样中不易流动水的含量最低，保水性最差；第5天时肉样中不易流动水的含量最高，保水性最好，这与前面弛豫信息中3种水分群的水分含量相吻合。

2.7 水分分布与持水性能的相关性分析

通过对宰后5个成熟时间点(0.5～7 d)牦牛肉水分分布和持水性能进行相关性分析，结果如表2所示。宰后P21与P22呈极显著负相关(R=-0.997，p<0.01)；P22与P23呈显著负相关(R=-0.933，p<0.05)；P23与滴水损失率(R=0.919，p<0.05)、表面疏水性指数(R=0.924，p<0.05)呈显著正相关；加压损失率与蒸煮损失率呈显著正相关(R=0.949，p<0.05)；滴水损失率与蒸煮损失率呈显著正相关(R=0.956，p<0.05)、与表面疏水性指数(R=0.984，p<0.01)呈极显著正相关。P21与P22以及P22与P23都呈极显著负相关，表明肌肉中不同状态水之间存在相互转变，P23与滴水损失率及表面疏水性指数显著正相关说明自由水是滴水损失产生的主要原因，文献[34]研究认为，宰后成熟过程中，部分内源酶导致蛋白降解，疏水残基的暴露使得表面疏水性增加，蛋白溶解度降低，进而对宰后不同阶段肌肉中不同状态水的分布和迁移产生影响，致使肌肉WHC发生变化。基于LF-NMR的水分分布与持水性能的相关性分析表明，可以用P23来表征牛肉的保水性，为建立宰后牦牛肉保水性理论体系奠定了一定基础。

表2 水分分布与持水性能的相关性分析Tab.2 Correlation analysis of water distribution and water holding capacity

注：*表示两种指标显著相关(p<0.05)；**表示两种指标极显著相关(p<0.01)。

3 结束语

在青海牦牛宰后成熟过程中，牦牛背最长肌加压损失率、滴水损失率、蒸煮损失率和表面疏水性指数均呈先升高、后降低的趋势，相互之间存在显著的正相关，第3天保水性能最差，牦牛背最长肌的保水性低于肉牛。利用LF-NMR技术分析牛肉水分分布规律，宰后初期蛋白疏水性增大，P22降低，P23升高，不易流动水状态转变为自由水，肌肉的保水性逐渐降低，后期恰好相反，因此两种水分群的状态转变成为影响保水性的关键因素，P23同时与滴水损失率及表面疏水性指数呈显著的正相关也反映出肉中的自由水是引起保水性变化的直接原因。核磁成像显示第5天氢质子密度最大，保水性最好。