法舒地尔对ICH大鼠炎性因子水平、神经及认知功能的影响

符 晶，孟开顺

(海南省三亚市人民医院老年病科，海南 三亚 572000)

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH )指的是非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，引起神经细胞的血供不足，导致周围的神经组织受到压迫而引发代谢及功能障碍[1]。脑出血病情凶险，死亡率高，是高血压病最严重的并发症之一,占全部脑卒中的20%～30%[2]。目前ICH的发病机制尚不明确，常见的病因有：微动脉瘤破裂、脂肪玻璃样变或纤维坏死、脑动脉粥样硬化以及脑动脉的外膜和中层在结构上薄弱等[3]。法舒地尔是Rho/Roek信号通路的选择性蛋白激酶抑制剂，Rho/Rho激酶信号通路可以为多种心血管疾病的预防和治疗提供治疗靶点。法舒地尔在急性脑缺血中的作用已得到证实[4]，但其对于脑出血脑损伤的影响及相关机制研究较少。本研究探讨盐酸法舒地尔治疗脑出血(ICH)大鼠对炎性因子水平、大鼠神经功能及认知功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年Wistar雄性大鼠36只，12周龄，体重250.4±9.0 g，均为SPF级别，喂养于室温23 ℃～25 ℃、相对湿度45%～60%、光照12 h的环境中。采用随机数字表法分为对照组、模型组和治疗组，每组12只。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 首先固定大鼠，将大鼠固定在小动物手术台上，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，使用从大鼠头部顺着人字缝皮肤切开大约3～5 cm，露出头骨。在人字缝右边1 mm处标记，使用穿孔器垂直钻孔。ICH大鼠模型采用非抗凝自体股动脉血注入右侧尾状核建立，使用微量进样器沿着小孔注射自体股动脉血50 μL，注射时间维持在5 min内，随后封闭小孔，缝合伤口。对照组只进行与模型组相同手术不注射药物。

1.2.2 治疗方法 术后3组大鼠同条件饲养，治疗组采取腹腔注射盐酸法舒地尔每天12 mg/kg治疗，模型组和对照组均给予等量的生理盐水进行腹腔注射。

1.2.3 Morris水迷宫试验 采用XR-XM101通用型Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)，实验训练阶段连续进行3天，每天训练4次。训练时，将大鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，对比各组大鼠的Morris水迷宫试验逃避潜伏期、穿越平台次数，操作步骤按照说明书进行。

1.2.4 神经功能缺损评分 大鼠神经功能评估应用Longa评分标准：正常，无神经功能缺损(0分)；左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损(1分)；行走时，大鼠向左侧旋转，中度神经功能缺损(2分)；行走时，大鼠向左侧倾倒，中度神经功能缺损(3分)；不能自发行走，存在意识丧失(4分)。

1.2.5 实验室指标检测 大鼠眼球取血，3500 r/min离心15 min，取上清，使用ELASA法测量血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，所用试剂盒购自上海纪宁生物，操作按照说明书进行。大鼠经麻醉处理后，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注后断头取脑，免疫组化测定脑组织NF-κB表达，荧光扫描结果。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠的神经功能缺损评分

在造模后第1天至第14天，模型组大鼠的Longa评分均显著的高于对照组(P<0.05)，治疗组大鼠的Longa评分显著的低于模型组(P<0.05)(表1)。图1为各组大鼠在脑出血后14天的血肿情况，对照组未发现血肿形成；模型组可见见图1所示血肿，血肿周围有较多的炎性细胞浸润；治疗组可见血肿基本被吸收，胶质细胞增生改变。

表1 各组大鼠的神经功能缺损Longa评分比较 (分)

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05(n=12)

图1 各组大鼠脑组织血肿情况(HE×40)

2.2 大鼠的Morris水迷宫试验逃避潜伏期、穿越平台次数

在造模后第3天至第14天，模型组大鼠的Morris水迷宫试验逃避潜伏期高于对照组(P<0.05)，穿越平台次数显著少于对照组(P<0.05)；治疗后，治疗组大鼠的Morris水迷宫试验逃避潜伏期低于模型组(P<0.05)，穿越平台次数高于模型组(P<0.05)；(表2)。

表2 各组大鼠的Morris水迷宫试验逃避潜伏期、穿越平台次数比较

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05(n=12)

2.3 大鼠炎性相关指标

在造模后第3天至第14天，与对照组比较，模型组大鼠的血清IL-6、TNF-α显著升高(P<0.05)；治疗后大鼠血清IL-6、TNF-α降低(P<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠炎性相关指标比较 (pg/mL)

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05(n=12)

2.4 大鼠脑组织中的NF-κB表达

在造模后第14天，处死大鼠，取出脑组织，可见模型组中的NF-κB阳性表达细胞较多，治疗组的NF-κB阳性表达细胞显著减少(图2)。阳性定量分析见表4，模型组大鼠脑组织中的NF-κB表达高于对照组(P<0.05)；治疗组大鼠脑组织中的NF-κB表达低于模型组(P<0.05)。

表4 各组大鼠脑组织中的NF-κB表达相对值比较

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05(n=12)

3 讨 论

脑出血具有较高的致残率和死亡率，已经成为威胁老年人健康的最重要因素。寻找有效的临床诊治措施十分必要。目前ICH的发病机制尚不明确，临床中绝大多数脑出血是因高血压合并小动脉硬化引起的。研究认为，长期的高血压可导致血管壁纤维素样坏死或脂质透明变性,形成小动脉瘤或夹层动脉瘤[6]。血压骤然升高时，血管容易破裂，血液进入脑组织形成血肿。此外，高血压会导致远端小血管痉挛，引发出血。脑出血的诱发因素有很多，发病机制尚未完全明确，所以缺乏功效明显的药物[7]。因此目前研究探讨脑出血的发生发展机制及研发高效的药物具有重要的临床意义。

图2 各组大鼠脑组织免疫组化染色(SP 200×)

分子免疫学和分子生物学的研究表明[8]，炎性反应在脑出血导致的神经功能缺损中起着重要作用。因此治疗脑出血可以从抑制炎性反应、减轻脑水肿、促进神经功能恢复方面入手。盐酸法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，为RHO激酶抑制物，具有拮抗炎性因子，保护神经抗凋亡，促进神经再生的作用。目前多项研究显示[9-10]，法舒地尔有助于改善脑缺血症状及伴随的神经元损伤。但其对于脑出血所致脑损伤的影响及相关机制未见报道。本研究观察法舒地尔在大鼠脑出血性损伤中是否具有保护作用，以及可能的作用机制。研究结果显示，在造模后第1天至第14天，模型组大鼠的Longa评分均显著的高于对照组，给予盐酸法舒地尔治疗后的大鼠Longa评分显著的降低，说明法舒地尔可以降低神经缺陷评分，与其他研究结果相一致[11]。有研究显示，经过法舒地尔治疗，慢性低灌注大鼠的认知功能损害有所减轻[12]。本研究Morris水迷宫试验结果显示，治疗组大鼠在第3天至第14天逃避潜伏期低于模型组，且穿越平台次数也增高；结果表明法舒地尔干预大鼠学习认知损害显著减轻，提示ROCK抑制剂对ICH引起的认知功能损害有保护作用。机制可能与法舒地尔抑制Rho激酶，减少梗死容积，促进神经功能恢复有关[13]。Sanjari等研究发现[14]，Rho激酶抑制剂可以显著抑制IL-6、T NF-α的分泌，其机制可能与抑制NF-κB信号通路、减少下游炎症因子有关。NF-κB 信号通路参与炎症反应，NF-κB作为转录因子在免疫系统中起到关键作用。研究显示，ICH后脑内NF-B表达上调，这可能与ICH的发病机制有一定关系[15]。本研究也发现，模型组大鼠的血清IL-6、TNF-α、NF-κB增高，给予法舒地尔治疗后大鼠血清IL-6、TNF-α、NF-κB降低；表明盐酸法舒地尔治疗ICH大鼠能降低 IL-6、TNF-α、NF-κB的表达水平，说明舒地尔治疗ICH大鼠可以抑制炎性因子释放，从而减少对神经细胞的损伤。

综上所述，盐酸法舒地尔治疗ICH大鼠能显著的改善大鼠神经及认知功能、降低脑出血后大鼠的炎症反应程度，具有一定的临床推广价值，但具体的作用机制有待进一步研究。