利用番茄cDNA酵母双杂交文库筛选Pti4互作蛋白

王洋 张政 王莹莹 冯国栋 陈丹阳 周宇 牛向丽

摘要以番茄的根、叶、花及不同发育时期的果实提取RNA，构建酵母双杂交文库。经检测，文库容量为1.1×107 CFU，阳性率大于95%，插入片段平均长度大于1 000 bp，可用于互作蛋白的筛选。依据番茄抗病途径相关基因Pti4编码序列设计引物，构建重组诱饵载体并转化酵母菌，筛选与Pti4相互作用的蛋白质。经初步检测获得6个可能与Pti4互作的转录因子，为进一步研究番茄Pti基因的作用机制提供了基础。

关键词番茄;酵母双杂交;Pti4;文库筛选;蛋白质相互作用

中图分类号Q 943.2文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of Pti4 Interaction Proteins by Using Yeast Two-hybrid cDNA Library of Tomato

WANG Yang，ZHANG Zheng，WANG Ying-ying et al（School of Food and Biological Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009）

AbstractRNA was extracted from tomato roots，leaves，flowers and fruits at different development stages to construct yeast two-hybrid library.The detection showed 1.1×107 CFU of total capacity of the library，and the positive rate was greater than 95% with average length of inserted fragments longer than 1 000 bp.According to the coding sequence of tomato disease-resistant Pti4 gene，primers were designed and the recombinant bait vector was constructed，then transformed into yeast to screen the proteins interacting with Pti4.The preliminary screening indicated that six transcription factors might interact with Pti4，which provided a basis for further investigation on the mechanism of Pti genes in tomato.

Key wordsTomato;Yeast two-hybrid;Pti4;Library screening;Protein interaction

番茄（Solanum lycopersicum）作为广泛种植的果蔬类经济作物，同时也是研究果实发育、营养品质调控，以及细菌性病害的模式植物[1-2]。斑点病是番茄种植生产过程中的主要细菌性病害。从抗病品种中通过图位克隆方法获得了番茄抗病基因Pto （P.s.pv.tomato），Pto可以识别病原菌注入植物细胞的效应蛋白、触发下游防御反应，在番茄的抗病过程中发挥着关键作用[3]。因此，对Pto介导抗病防御途径的研究有重要意义。利用酵母双杂交，Pto被发现可以与3个转录因子相互作用，它们被命名为Pto interaction protein （Pti），即Pti4、Pti5和Pti6[4-6]。该课题组也进一步利用植物表达系统验证了它们在植物体内的相互作用[7]。但对Pti基因的作用机制仍缺乏深入了解。

已有的研究报道认为，Pti可能是Pto途径下游基因，可以与许多病程相关基因的启动子GCC box元件特异结合，激活病程相关基因的表达[8-9]，同时，Pti编码产物类似于烟草乙烯反应元件结合蛋白[10]，而乙烯作為一种植物激素，具有促进果实成熟、参与植物抗病免疫反应等广泛的调控作用[11]。因此，Pti4/5/6的发现意味着抗病基因与植物激素、基础防御基因，以及生长发育调控之间的必然联系。在拟南芥中转入Pti4基因，增强了植株对病原细菌的抵抗能力，对真菌致病菌的耐受能力也明显提高。与野生型拟南芥幼苗相比，在不含乙烯时，Pti4过表达幼苗下胚轴的生长受到抑制，在乙烯反应突变体ctr中，Pti4转化植株幼苗没有表现出根系生长的严重抑制或明显的顶端弯钩。因此，Pti4的表达似乎激活了乙烯的部分应答[6]。这些结果提示Pti4基因可能参与番茄抗病防御、生长发育等多个过程，但近年来对Pti基因的研究较少。在高等植物中很多转录因子与其他蛋白质相互作用，共同实现对植物生命活动的精细调控。除了Pto蛋白，Pti的互作蛋白信息也还未见报道。该研究将利用番茄的根、叶、花，以及不同时期的果实用于构建酵母双杂交cDNA文库，通过文库筛选获得Pti互作蛋白信息，以利于后续对其分子作用机制进行探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。所用的野生型番茄品种AC+来自美国康奈尔大学THOMPSON植物研究所，由该实验室繁育保存。收集番茄根、叶、花、果实组织，用于构建酵母双杂交文库。

1.1.2菌株与载体。大肠杆菌菌株E.coli菌株DH5α、KC8，酵母菌株EGY48，以及pEG202、pJG4-5载体，由该实验室保存。

1.1.3试剂与药品。质粒提取试剂盒（Qiagen），Oligotex mRNA Kit （Qiagen），Trizol （Invitrogen）、反转录酶（Invitrogen），DNA连接酶（NEB），限制性内切酶（Takara），DNA聚合酶（Takara），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal，Sigma-Aldrich），聚乙二醇3350 （PEG3350，Sigma-Aldrich），鲑鱼精 DNA （Carrier DNA，Sigma-Aldrich），酵母氮源[Yeast nitrogen base without amino acid，生工生物工程（上海）股份有限公司]，棉籽糖[Raffinose，索萊宝（北京）科技有限公司]，半乳糖[Galactose，索莱宝（北京）科技有限公司]，葡萄糖[Glucose，索莱宝（北京）科技有限公司]，醋酸锂[LiAc，生工生物工程（上海）股份有限公司]，氨基酸[包括色氨酸、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，所有氨基酸均购于生工生物工程（上海）股份有限公司]。所有试剂与药品均为国外原装或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1番茄酵母双杂交cDNA文库构建。取野生型番茄品种AC+植株的根、叶、花、果实（包括未成熟期、绿熟期、转色期、转色后10 d，4个不同时期），分别液氮研磨提取RNA，采用琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop 2000检测RNA浓度与质量。根据Oligotex mRNA Kit说明分离纯化mRNA，并按RNA浓度将各组织样品等量混合，反转录合成cDNA用于建库。

按照Clontech公司酵母双杂交文库构建方法，继续将合成的双链cDNA加5接头，并进行均一化处理。再利用同源重组方法，将纯化的双链cDNA与酶切的双杂交pJG4-5载体进行连接，连接产物纯化后电转化大肠杆菌感受态 细胞。

取转化菌液10 μL稀释100倍，从中取出10 μL涂布于加入氨苄青霉素的培养板。统计培养皿上生长的克隆数，计算文库容量（每皿平均克隆数/涂布体积×稀释倍数×转化体积）。挑取平板上的单克隆，通过载体特异引物PJG4-5-F：CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG、PJG4-5-R：AAGCCGACAACCTTGATTGGAG进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，鉴定阳性率及插入片段大小。

1.2.2Pti4载体构建与酵母转化。根据番茄Pti4基因（AK319979）编码区序列设计引物：Pti4-FSacⅡ：TCCCCGCGG ATGGATCAACAGTTACCACCG;Pti4-RApaⅠ：CATGGGCCCTTAAATGACCAATAGTTGAT GGACACC，分别引入SacⅡ、Apa Ⅰ酶切位点。以番茄叶片cDNA为模板进行PCR扩增，将预期大小扩增条带进行胶回收，连接于载体pEG202，转化大肠杆菌。经酶切鉴定、测序，构建pEG202-Pti4钓饵（bait）载体。

利用PEG/LiAc法将pEG202-Pti4载体转化酵母EGY48感受态，并对酵母单克隆进行PCR菌落鉴定。将转化酵母单克隆划线于带有X-gal的培养基进行显色[13]，检测诱饵载体pEG202-Pti4是否对酵母细胞具有毒性，以及是否具有直接激活报告基因的自激活活性。

1.2.3酵母双杂交文库筛选Pti4互作蛋白。

以带有pEG202-Pti4质粒的酵母细胞制备感受态。参照Golemis等[3]所述文库筛选试验方法将上述酵母感受态细胞与所构建文库的质粒、carrier DNA按比例混合、分装后，用涂布棒均匀涂布于三缺（-His/-Trp/-Ura）固体培养基上，培养生长至单克隆出现，将菌体刮下加等量甘油保存。取少量上述转化菌液培养后进行梯度稀释分别涂布于四缺（-His/-Trp/-Ura/-Leu）固体培养基，待酵母单克隆生长后转移至新的四缺固体培养基。然后再将所生长酵母单克隆转移至三缺固体培养基进行封闭，最后将酵母单克隆转至含X-gal的显色固体培养基，观察LacZ及Leu报告基因的表达情况，蓝色克隆即为阳性克隆。将阳性克隆进行酵母质粒抽提，质粒电转化E.coli菌株 KC8 （仅转入文库质粒的转化菌才能生长）。经菌落PCR鉴定KC8阳性，提取质粒用于酵母双杂交验证和测序。对测序获得的文库插入序列进行Blast比对分析。

2结果与分析

2.1番茄cDNA酵母双杂交文库的构建将野生型番茄AC+植株的根、叶、花、不同生长发育时期果实（包括未成熟期、绿熟期、转色期、转色后10 d），分别液氮研磨提取RNA。琼脂糖凝胶电泳显示，RNA条带清晰，核糖体条带清晰且完整 （图1）。RNA浓度均大于300 ng/μL，A 260/A 280 为2.01～ 2.08，显示RNA质量良好，可用于mRNA分离和反转录。

双链cDNA加5接头、均一化处理后与pJG4-5载体进行连接，连接产物经纯化后转化大肠杆菌感受态细胞。取 10 μL转化菌液稀释100倍后取10 μL涂布于加入氨苄青霉素的培养板。培养皿平均生长克隆数为210，计算文库容量为：每皿平均克隆数（210个）/涂布体积（10 μL）×稀释倍数（100倍）×转化体积（5 000 μL） =1.1×107 CFU。随机挑取24个克隆，以载体特异引物进行PCR扩增，电泳结果显示均有扩增产物，插入片段平均长度大于1 000 bp。结果表明，所构建酵母双杂交文库质量满足要求。

2.2Pti4基因酵母双杂交载体构建以番茄叶片cDNA为模板，Pti4基因编码区序列特异引物扩增得到702 bp预期大小PCR产物，纯化后经Sac Ⅱ、Apa Ⅰ酶切、胶回收，连接于pEG202载体，并转化大肠杆菌。经酶切鉴定、测序，结果表明获得pEG202-Pti4钓饵载体（图2）。将pEG202-Pti4载体转化酵母菌株EGY48感受态，并对酵母单克隆进行PCR菌落鉴定。阳性转化酵母单克隆划线于X-gal显色培养基， 28 ℃生长2 d后酵母克隆正常生长，且未显示蓝斑。表明Pti4的转入并未对酵母细胞显示毒性，在不转入其他外源基因时Pti4对报告基因也不具有激活活性。