PDCD4对高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

缑丽莎，郑贝贝，齐亚丹，张翼

(周口市中心医院内分泌科，河南 周口466000)

糖尿病是一种糖、蛋白质、脂肪等代谢紊乱的慢性疾病，糖尿病主要是由于机体内的胰岛素不足引起的，β细胞是一种内分泌细胞，其具有分泌胰岛素的作用，胰岛β细胞分泌胰岛素主要受到血糖的影响[1,2]。研究表明，胰岛β细胞过度凋亡引起的胰岛β细胞功能异常是糖尿病胰岛β细胞损伤发生的重要原因之一，探讨高糖环境下胰岛β细胞损伤机制对于研究糖尿病的发病机制具有重要意义[3]。程序性细胞死亡4(programmde cell death 4,PDCD4)是一种新发现的抑癌基因，其参与调控蛋白质翻译、基因的转录过程，在细胞程序性死亡过程中发挥促进作用[4]。近年来的研究显示，PDCD4参与糖尿病发生过程，与高糖环境下的心肌细胞、血管内皮细胞等细胞损伤发生有关[5-7]。本研究通过下调胰岛β细胞中PDCD4的表达水平，探讨敲低PDCD4在高糖诱导的胰岛β细胞损伤中的作用，为明确糖尿病胰岛β细胞损伤机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 胰岛β细胞INS-1购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司;PDCD4 siRNA重组慢病毒、阴性对照慢病毒由吉满生物科技(上海)有限公司构建；GAPDH、PDCD4引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Realtime PCR试剂盒(SYBR Green)购自上海索宝生物科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide Orgotein Dismutase,SOD)含量检测试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司；胰岛素含量检测试剂盒购自北京利维宁生物科技有限公司；活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗体购自美国CTS。

1.2 慢病毒感染和分组 INS-1细胞接种到12孔细胞培养板内，细胞密度为35%左右时，取慢病毒液，添加到细胞中，感染复数为10，同时添加Polybrene(终浓度为 6mg/L)，放在 37℃，5%CO2 培养箱内培养过夜，将病毒液吸弃，加入完全培养液，观察细胞融合度为90%，观察绿色荧光表达情况，感染效率高于90%。分别取稳定感染PDCD4 siRNA重组慢病毒、阴性对照慢病毒的INS-1细胞用含有25mmol/L葡萄糖的细胞培养液培养依次记为干扰组、阴性对照组，同时取没有感染慢病毒的INS-1细胞用含有25mmol/L葡萄糖的细胞培养液培养记为高糖组，没有感染慢病毒的INS-1细胞用含有5.5mmol/L葡萄糖的细胞培养液培养记为对照组。以Realtime PCR和Western blot检测高糖组、阴性对照组、干扰组细胞中PDCD4的表达变化，确定PDCD4 siRNA对高糖条件下INS-1细胞中PDCD4敲低效果。

1.3 Realtime PCR检测PDCD4表达变化 高糖组、阴性对照组、干扰组细胞培养48h以后，用Trizol试剂提取各组胰岛β细胞中的总RNA，取1μg的RNA样品，反转录合成cDNA后，根据Realtime PCR试剂盒(SYBR Green)检测PDCD4表达变化。PDCD4引物：上游5，-CCAAAGAAAGGTGGTGCA-3’，下游 5，-TGAGGTACTTCCAGTTCC-3’。 内参 GAPDH引物： 上游：5，-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3’， 下游 5，-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。根据每个样本反应的Ct值，得到△Ct，根据2-△△Ct方法计算PDCD4表达变化。

1.4 Western blot检测PDCD4表达变化 高糖组、阴性对照组、干扰组细胞培养48h以后，添加细胞裂解溶液，冰浴40min后，在4℃，12000g离心10min，吸取上清(即蛋白溶液)，用BCA方法检测蛋白浓度以后，添加Loading Buffer混合，置于沸水中煮5min后，添加至蛋白凝胶上样孔内，每个孔内的蛋白量为30μg，接入电源，50V电压观察蓝色条带进入到分离胶和浓缩胶的交接处以后，把电压调整为120V，等到蓝色条带跑出分离胶时，终止电泳。在300mA电流条件下将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，转膜时间为100min，PVDF膜置于含有封闭液(5%牛血清白蛋白)的平皿内，放在室温反应2h。把PVDF膜放在抗体孵育袋中，以1mL/cm2添加 PDCD4 抗体(1：600)，封口，放在 4℃中过夜，同样的方法与二抗反应后，化学发光，用Vision Workers LS分析光密度值，内参为GAPDH。

1.5 CCK8检测增殖变化 INS-1细胞按照105个/mL细胞密度接种到96孔板内，按照对照组、高糖组、阴性对照组、干扰组分组方法处理细胞，培养48h后，在每孔中添加CCK8工作液10μL，继续孵育4h后，调整酶标仪波长为450nm，以不含细胞的孔调零以后，测定每孔的OD值，把对照组细胞存活率设置为100%，分析高糖组、阴性对照组、干扰组细胞存活率变化。

1.6 流式细胞术检测凋亡变化 按照对照组、高糖组、阴性对照组、干扰组分组方法处理细胞，培养48h后，用PBS将细胞悬浮，4℃离心后，弃上清，添加300μL的结合缓冲液，再加入PI和Annexin VFITC染色以后，继续加入200μL的结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。

1.7 Western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白水平变化 按照对照组、高糖组、阴性对照组、干扰组分组方法处理细胞，培养48h后，用Western blot方法检测细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平，步骤同1.4。

1.8 细胞中MDA、SOD水平检测 按照对照组、高糖组、阴性对照组、干扰组分组方法处理细胞，培养48h后，用黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性，硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.9 细胞分泌胰岛素水平检测 按照对照组、高糖组、阴性对照组、干扰组分组方法处理细胞，培养48h后，吸取培养液上清用ELISA法检测胰岛素水平，步骤按照试剂盒说明书进行。

1.10 统计分析 实验数据用SPSS21.0软件分析，数据按照均数标准差(meanSD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDCD4 siRNA降低高糖环境下胰岛β细胞中PDCD4表达水平 PDCD4 siRNA可以明显下调高糖环境下胰岛β细胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平，构建了高糖条件下敲低PDCD4表达的胰岛β细胞。见图1、表1。

图1 Western blot检测PDCD4 siRNA对高糖环境下胰岛β细胞中PDCD4表达影响

表1 PDCD4 siRNA对高糖环境下胰岛β细胞中PDCD4表达影响(meanSD)

2.2 敲低PDCD4提高高糖条件下胰岛β细胞增殖活性并减少细胞凋亡 高糖条件下胰岛β细胞的存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高。敲低PDCD4后的胰岛β细胞经过高糖处理后，细胞的存活率升高，细胞凋亡率降低，细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平下降。敲低PDCD4可以逆转高糖对胰岛β细胞增殖抑制和凋亡促进作用。见图2、表2。

2.3 敲低PDCD4降低高糖条件下胰岛β细胞氧化损伤 高糖条件下胰岛β细胞中MDA含量升高，SOD活性降低。敲低PDCD4后的胰岛β细胞经过高糖处理后，细胞中MDA含量减少，细胞中SOD活性升高。敲低PDCD4可以提高高糖环境下胰岛β细胞抗氧化酶活性，减少细胞氧化损伤。见表3。

图2 敲低PDCD4对高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的影响

表2 敲低PDCD4对高糖环境下胰岛β细胞增殖凋亡影响(meanSD)

表3 敲低PDCD4对高糖环境下胰岛β细胞中MDA、SOD水平影响(meanSD)

2.4 敲低PDCD4提高高糖条件下胰岛β细胞分泌胰岛素水平 高糖条件下胰岛β细胞分泌的胰岛素水平降低。敲低PDCD4后的胰岛β细胞经过高糖处理后，细胞分泌的胰岛素水平升高。敲低PDCD4可以提高高糖环境下胰岛β细胞分泌胰岛素水平。见表4。

3 讨论

胰岛β细胞异常是糖尿病发生的直接原因，胰岛β细胞数量急剧减少导致细胞分泌的胰岛素不足，进而诱发蛋白质、糖等物质代谢紊乱[8]。氨基酸、激素、高血糖等都是诱导胰岛β细胞功能异常的诱发因子，其中高血糖是最为重要的诱导因子[9,10]。高血糖诱导胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌减少[11]。本实验的结果显示，高糖处理后的胰岛β细胞增殖活性降低，细胞凋亡增多，细胞分泌的胰岛素减少，提示成功构建了糖尿病胰岛β细胞体外损伤模型。

表4 敲低PDCD4对高糖环境下胰岛β细胞分泌胰岛素水平影响(meanSD)

本次实验研究用PDCD4 siRNA下调胰岛β细胞中PDCD4的表达水平，发现细胞增殖能力升高，细胞凋率降低，敲低PDCD4具有少高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的作用，这可能提示，PDCD4在糖尿病胰岛β细胞损伤中发挥促进作用。PDCD4是在小鼠体内发现的凋亡相关基因，后续在人类及大鼠等生命体内发现PDCD4的存在，人类PDCD4基因定位在10q24染色体上，其编码的蛋白质由469个氨基酸组成，其氨基侧含有一个MA3结构域，该结构域参与真核细胞翻译起始因子的激活过程，具有抑制核糖体复合物及蛋白合成的作用，PDCD4蛋白的氨基和羧基的末端含有核定位信号和核输出信号，另外，PDCD4蛋白还含有多个蛋白激酶的磷酸化位点，PDCD4的这些结构特点决定了其具有多种生物学功能，参与细胞生长凋亡过程[12-14]。PDCD4具有促细胞凋亡、促进氧化应激等作用，不仅参与正常细胞生理功能发生，还参与病理状态下细胞损伤过程，PDCD4在动脉粥样硬化、肿瘤、糖尿病、肥胖等疾病中均发挥关键作用，PDCD4基因缺失的小鼠经高脂饲喂后，小鼠发生肥胖的数量明显降低，PDCD4还参与高糖诱导的心肌细胞、血管内皮细胞等多种细胞损伤发生，还有研究显示，敲低PDCD4的表达可以抑制糖尿病条件下胰岛β细胞的缺失，敲低PDCD4可能具有保护胰岛β细胞的作用[15-18]。上述实验研究报道同我们的实验结果一致，说明敲低PDCD4具有抑制糖尿病胰岛β细胞损伤的作用。

高糖诱导的胰岛β细胞损伤与氧化应激等有关，SOD是细胞内氧自由基清除的抗氧化酶，MDA是细胞内脂质发生过氧化的产物，SOD活性降低导致氧自由基大量积累诱导氧化损伤[19]。另外，细胞内过量的氧自由基能够诱导Caspase凋亡反应，引起细胞凋亡发生，Caspase-3是细胞凋亡的执行因子，其活化后可以促进细胞凋亡发生[20,21]。PDCD4表达水平的高低与细胞抗氧化能力、细胞凋亡水平等密切相关[22]。本实验表明，敲低PDCD4可以提高高糖环境下胰岛β细胞中SOD活性，降低细胞中MDA水平，减少细胞凋亡，提示敲低PDCD4具有抑制高糖诱导的胰岛β细胞氧化应激和细胞凋亡的作用。

总之，敲低PDCD4对高糖诱导的胰岛β细胞功能损伤具有保护作用，其可能通过减少氧化应激诱导的细胞凋亡促进胰岛β细胞分泌胰岛素，这为研究糖尿病条件下胰岛β细胞损伤机制提供了参考。目前对于其具体的作用机制尚不明确，在以后的研究中会进行探讨。