MiR-149 rs22928323位点基因多态性与RA相关性分析

喻景奕，周公社

(周口市中心医院骨科，河南 周口466000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病[1]。RA的发病机制复杂，目前认为RA是一种自身免疫性疾病。研究显示，T细胞介导的免疫反应和促炎因子的分泌在RA的发生与进展中发挥了重要作用[2]。micro RNA(miRNA)是一类内源性非编码RNA，其生物学功能广泛，包括凋亡、细胞分化、代谢、病毒防御等[3]。目前已有针对 RA发生、发展中miRNA变化的研究，其中miRNA-149与RA关系密切。本研究探讨微小RNA-149(MiR-149)rs22928323位点基因多态性与类风湿关节炎(RA)发病的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取确诊的RA患者90例(RA组)、健康自愿者90例(健康组)，收集时间2014年1月-2016年12月。RA组，男14例、女76例，年龄42～78岁，平均55.9±11.6岁。健康组，男18例、女72例，年龄38～79岁，平均56.1±12.4岁。两组患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。

1.2纳入排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)RA患者的诊断标准参考类风湿关节炎诊断及治疗指南[4]；(2)患者血清类风湿关节因子(RF)阳性；(3)手腕及关节X线片检查确诊；(4)对照组来源于门诊体检的健康自愿者；(5)获得研究对象的知情同意及医学伦理委员会的批准。

1.2.2 排除标准 (1)伴有严重感染；(2)肿瘤疾病；(3)伴有免疫功能缺陷、低下；(4)近1个月使用糖皮质激素、免疫抑制；(5)伴有严重的肝肾功能障碍。

1.3 基因检测方法 抽取患者和健康自愿者外周静脉血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用 Trizol试剂盒(购自美国 Invitrogen公司)提取血清总 RNA，方法按照试剂盒说明书进行。使用PCR－RFLP分析技术测基因型，PCR引物引用文献中成熟引物，由Invitrogen公司合成。限制性内切酶Pvu II从NEBcutter查找并确定。 PCR 体系为 10μl，2×Mix 10μl，Primer F 1μl，Primer R 1μl，DNA 5μl，ddH2O 3μl，退火温度58℃，PCR产物电泳琼脂糖凝胶浓度2%，32个循环后得到长度为254 bp的代表基因型为CC的PCR片段。产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 收集指标 外周血白细胞(WBC)、血小板(PLT)、采用XT-2000全自动全血分析仪检测。尿蛋白、尿WBC采用罗氏Cobas C8000全自动生化分析仪检测。抗角蛋白抗体(AKA)采用和杰创新诊断试剂公司大鼠食管抗原片间接免疫荧光法检测患者血清AKA。血清抗CCP抗体检测采用ELISA法检测，试剂盒购自德国欧洲诊断试剂公司，操作按照说明书进行。

1.5 统计学方法 统计软件采用SPSS16.0，采用均数±标准差()进行统计描述，两组间比较采用两组独立样本的t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；多因素分析采用Logistic回归分析法；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的MiR-149 rs22928323位点基因多态性检测结果比较 RA组患者的MiR-149 rs22928323位点TC基因型50.00%高于健康组的28.89%(P＜0.05)，RA组的等位基因 T的频率51.67%显著的高于健康组的36.67%(P＜0.05)；见表1，图 1。

表1 两组患者的MiR-149 rs22928323位点基因多态性检测结果比较[n(%)]

图1 MiR-149 rs22928323位点的TC、CC、TT三种基因型电泳图

2.2 两组患者的一般资料检测结果比较 RA组和健康组的年龄、性别、WBC、PLT、尿 WBC比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；RA组的尿蛋白、AKA阳性率、CCP阳性率均显著的高于健康组(P＜0.05)；见表2。

2.3 多因素分析结果 Logistic回归分析显示：AKA阳性表达、CCP阳性表达、等位基因T的频率增加是人群RA发病的独立危险因素(P＜0.05)；见表3。

3 讨论

RA是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病，主要表现为关节滑膜炎，终致关节的软骨、韧带、肌腱等各种组织以及多脏器损害[5]。RA的发病机制至今尚未明确，随着对免疫学，分子生物学研究的不断深入，RA的治疗虽取得一定进展，但至今仍处于控制或缓解症状阶段，至今尚无特效治疗。研究认为，遗传背景、环境差异、细胞凋亡、病毒感染等因素都与RA的发病密切相关[6]。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞内具有多种重要的调节作用[7]。miRNA可以与mRNA结合来抑制Mrnade转录，因此对基因表达调控、细胞周期等生理过程起重要的调控作用。目前对miRNA的研究较为广泛,miRNA作为抑癌基因或癌基因与肿瘤发生密切相关，低表达的miRNA与细胞分化缺失有关，在某些肿瘤中 miRNA出现高表达的情况。Chen Y[8]等研究发现，肿瘤的发展谱系及分化程度和 miRNA表达谱一致。miRNA在免疫系统也中发挥重要作用，研究发现[9]，miRNA-520可以使造血干细胞的分化速度明显加快。

表2 两组患者的一般资料检测结果比较

表3 RA发病的多因素分析结果

因此，miRNA被认为是新的疾病标记和潜在的疾病治疗靶点，研究miRNA的单核苷酸多态性与疾病的相关性是很有价值的。目前已有针对RA发生、发展中miRNA变化的研究。已有文献证明某些特定的 miRNA通过对免疫相关基因的调节与RA的发生发展密切相关。例如Zhou[10]等研究发现，miRNA-146与RA的发病密切相关，可以控制在软骨和滑膜的炎性反应，从而减少骨关节炎的相关感觉过敏。Rodriguez[11]等研究发现，miRNA-155可通过抑制基质金属蛋白酶的分泌来减缓关节的损坏。

抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体和抗角蛋白抗体(AKA)是近年来发现对RA的诊断具有重要价值[12]。两者联合检测，对于筛查和辅助诊断早期RA有重要价值。PCR—RFLP分析技术是在PCR技术基础上发展起来的DNA标记技术，原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。应用PCR—RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断。本研究中RA组的AKA阳性率、CCP阳性率均显著的高于健康组(P＜0.05)；符合文献报道[13]。 RNA-149 可以负反馈调节TLR介导的免疫反应过程，RNA-149(MiR-149)rs22928323多态性位点位于前体，与肺癌、缺血性脑卒中等疾病的发生相关。有研究显示，MiR-149的rs22928323多态性位点与RA的遗传易感性相关[14]。本研究结果显示，RA组患者的MiR-149 rs22928323位点TC基因型50.00%高于健康组的28.89%(P＜0.05)。RA组的等位基因T的频率51.67%显著的高于健康组的36.67%(P＜0.05)；OR=1.911，表明MiR-149 rs22928323单核苷酸多态性与类风湿性关节炎的发病风险相关。与肖茗渊[15]等的研究结果相一致，即等位基因T为风险等位基因。同时Logistic回归分析显示：AKA阳性表达、CCP阳性表达、等位基因T的频率增加是人群RA发病的独立危险因素(P＜0.05)。进一步证实了等位基因 T为风险等位基因。但具体的调节机制尚不明确，目前的分析并没有发现三个基因的多态性与样本临床资料的相关性，因此有待进一步研究。探讨miRNA内部调节机制在疾病发病中的作用，有助于寻找调节免疫应答的靶点，以 miRNA为靶点设计药物，进行RA靶向治疗。

综上所述，miRNA-149通过对免疫相关基因的调节，其单核苷酸多态性与类风湿性关节炎的发病密切相关。RNA-149(MiR-149)rs22928323位点等位基因T频率增加是人群RA发病的独立危险因素。随着研究的不断深入，以miRNA为靶点设计药物，将会为RA的治疗带来新的希望。